背景癫痫(epilepsy)是一种慢性的神经系统疾病,具有发病的不可预见性与症状表现多样性的临床特点。目前全世界范围内约有6500万患者,其中约30%的患者属于难治性癫痫,对多种抗癫痫药物(anti-epileptic drugs,AEDs)不敏感。该病的主要危害是使人丧失身体的自主权,同时伴随较为明显的心理压力与社会歧视。调查发现,癫痫的严重程度与患者的死亡风险关系密切,发病的危险因素主要包括日常生活压力、疲劳、注意力缺陷/多动障碍和脑器质性损害等。有假说提出,大脑中的免疫炎症反应可能是触发痫性发作的关键因素,但确切机制仍待证实。细胞自噬是真核生物对细胞内容物的代谢清除过程,是巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬三种特定清除活动的通用术语,通过动态降解受损细胞器和异常蛋白质而起到细胞内稳态维持的作用。巨自噬(本文中称为“自噬”)作为自噬的主要亚型,先由胞内分离膜吞噬蛋白质或细胞器的分离片段形成自噬体,随后自噬体与溶酶体融合后形成自噬溶酶体,降解清除内容物,参与包括亨廷顿病、阿尔茨海默病、帕金森病等多种神经退行性疾病的发病过程。最近研究证实,自噬与癫痫的发生发展关系密切,但其在疾病中的作用仍需深入探讨。高迁移率族蛋白-1(high-mobility group box 1,HMGB1)是一种高度保守的核蛋白,广泛存在于真核细胞中,主要参与核小体的构建、修饰,协调基因的转录、复制、重组等。近年来研究发现,HMGB1是细胞自噬的关键调控因子,可诱导自噬的发生,同时还具有“细胞因子”的特性,影响免疫炎症反应过程。抑制HMGB1活性可有效降低实验动物的痫性发作频率,减少海马神经元凋亡损伤。本课题采用匹罗卡品(pilocarpine,PILO)诱导的癫痫小鼠模型探寻HMGB1在癫痫发病过程中的变化规律,明确HMGB1中和抗体对海马神经元自噬与凋亡机制的影响及在癫痫发作所致空间记忆损伤中的作用,试图从多个角度探讨HMGB1在癫痫海马损伤中的可能机制,为癫痫病因学研究及抗癫痫药物的研发提供新思路。第一部分:HMGB1在癫痫小鼠海马损伤中的作用研究研究目的探讨腹腔注射PILO诱导小鼠癫痫模型海马组织内HMGB1不同时程的变化规律及HMGB1中和抗体对癫痫发作所致神经元损伤的影响。研究方法1.利用腹腔注射的方法建立PILO致痫小鼠模型。选取8周龄的健康雄性小鼠,随机分为4组:正常组(正常小鼠)、致痫组(癫痫小鼠注射PBS)、IgG组(癫痫小鼠注射IgG)和HMGB1 Ab组(癫痫小鼠注射HMGB1中和抗体)。2.观察致痫小鼠行为学和脑电图结果。3.实时定量PCR技术(RT-PCR)和免疫印迹法(Western Blot)检测HMGB1在癫痫小鼠海马组织中的动态变化。4.HE和Nissl染色观察各组小鼠海马组织神经元形态。研究结果1.正常小鼠的行为学表现及脑电波形均正常。根据Racine癫痫发作标准,在腹腔注射PILO后,致痫组、IgG组和HMGB1 Ab组小鼠痫性发作级别可达到IV-V级,并可出现癫痫持续状态(status epilepticus,SE),三组小鼠致痫成功率及发作潜伏期(注射PILO到SE的时间)均无显著性差异。SE后24h,致痫组、IgG组和HMGB1 Ab组小鼠脑电波均存在异常表现,呈爆发性、持续性、丛集性高波幅高节律的多棘波。SE后4w,三组小鼠脑电波仍可见异常典型多棘波,但HMGB1 Ab组小鼠较致痫组和IgG组相比,脑电波波幅明显降低。2.RT-PCR检测发现,SE后12h开始,致痫组小鼠海马HMGB1 mRNA表达开始显著高于正常组(P<0.05),且24h、72h、4w各时间点,两组差异更加显著(P<0.01)。Western Blot实验结果显示,SE后24h开始,致痫组小鼠海马HMGB1蛋白表达量显著高于正常组(P<0.01),并至少持续4w之久(P<0.01)。3.HE染色显示,正常小鼠海马锥体细胞层及颗粒细胞层呈带状分布,排列整齐,无细胞缺失,神经元排列紧密,形态完整,有规律,胞浆透明,细胞核呈圆形或椭圆形,染色质分布均匀,核仁清晰,形态正常。致痫组、IgG组小鼠海马CA1区神经元损伤严重,神经元细胞肿胀破裂,结构不完整,间隙增大,排列不整齐,出现胞核固缩、变小,而HMGB1 Ab组小鼠海马CA1区中可见大部分边缘清晰的锥体细胞,形态正常,完整形态的神经元数量较致痫组、IgG组显著增多。Nissl染色显示,癫痫小鼠海马组织切片中的尼氏小体数/每视野均不足50,与正常小鼠相比(130/每视野)显著降低(P<0.01)。其中,HMGBI Ab组的尼氏小体数目较致痫组、IgG组有明显增多,差异有统计学意义(P<0.01)。研究结论PILO致痫小鼠海马HMGB1表达水平的升高,伴随着明显的海马神经元损伤。HMGB1中和抗体可改善小鼠异常脑电图,减轻CA1区海马神经元损伤,证实HMGB1中和抗体对癫痫小鼠海马神经元具有保护作用。第二部分:HMGB1中和抗体在癫痫小鼠海马神经元自噬及凋亡机制中的研究研究目的研究HMGB1中和抗体对PILO致痫小鼠海马神经元自噬和凋亡活性的影响。研究方法1.利用腹腔注射的方法建立PILO致痫小鼠模型。选取8周龄的健康雄性小鼠,随机分为5组:正常组(正常小鼠)、致痫组(癫痫小鼠注射PBS)、IgG组(癫痫小鼠注射IgG)和HMGB1 Ab组(癫痫小鼠注射HMGB1中和抗体)和3-MA组(癫痫小鼠注射3-MA)。2.透射电镜观察海马神经元自噬相关超微结构。3.荧光双染检测各组小鼠海马CA1区LC3和NeuN的表达变化。4.荧光双染检测各组小鼠海马CA1区神经元凋亡情况。5.RT-PCR法检测各组小鼠海马自噬相关基因转录水平的变化。6.Western Blot检测各组小鼠海马HMGB1蛋白、自噬和凋亡相关蛋白表达的变化。研究结果1.HMGB1中和抗体对癫痫小鼠海马神经元自噬的影响1.1 HMGB1中和抗体对癫痫小鼠海马神经元自噬相关超微结构的影响正常组中小鼠海马CA1区结构清晰完整,细胞器丰富,超微结构正常,几乎看不到自噬泡。致痫组和IgG组中,自噬溶酶体及自噬体数量增加,在胞质内形成大小不等的空泡,细胞器数量变少,胞膜结构破坏,而HMGB1 Ab组和3-MA组的上述病理改变均有一定程度缓解,自噬溶酶体及自噬体减少。1.2 HMGB1中和抗体对癫痫小鼠海马组织自噬相关基因转录水平的影响在SE后4w时,致痫组小鼠Beclin 1、ATG5和ATG7 mRNA表达水平显著高于正常组,差异有统计学意义(P<0.01)。HMGB1 Ab组小鼠与致痫组和IgG组相比,三种基因的mRNA表达量明显降低(P<0.05)。1.3 HMGB1中和抗体对癫痫小鼠海马组织自噬相关蛋白表达的影响Western Blot结果显示,与正常组相比,致痫组小鼠海马HMGB1蛋白、自噬相关蛋白Beclin 1、ATG5、ATG7的表达量和LC3Ⅱ/Ⅰ都显著提高(P<0.01),而p62蛋白呈低水平表达(P<0.01)。给药HMGB1中和抗体或3-MA后,上调的HMGB1、自噬相关蛋白和LC3Ⅱ/Ⅰ的表达显著下降(P<0.01),下调的p62蛋白表达却上有所上升(P<0.01)。1.4荧光双染检测小鼠海马CA1区LC3和NeuN的表达正常小鼠海马CA1区神经元中检测到细胞核周围聚集的LC3荧光信号非常低,呈弥散状表达;致痫组和IgG组中核周聚集的LC3荧光信号明显增强。HMGB1中和抗体和3-MA干预后,两组小鼠LC3的荧光信号较致痫组明显减弱,NeuN荧光信号有所恢复。与正常组比较,致痫组小鼠海马CA1区表达LC3的神经元数量占比明显增高(P<0.01);而在HMGB1 Ab组或3-MA组中,这一比例明显下降,与致痫组和IgG组相比,差异有统计学意义(P<0.01)。2.HMGB1中和抗体对癫痫小鼠海马神经元凋亡的影响2.1荧光双染检测海马神经元凋亡情况在SE后4w的癫痫小鼠海马CA1区观察到大量聚集的TUNEL荧光信号,并与NeuN信号分布基本一致。经HMGB1中和抗体或3-MA处理后,NeuN信号明显增强,而凋亡信号明显减弱。与正常组比较,致痫组小鼠凋亡神经元数量占总神经元数量的比重明显增高(P<0.01),而HMGB1 Ab组和3-MA组小鼠凋亡神经元的比重显著下降,仅为致痫组的1/3,差异有统计学意义(P<0.01)。2.2 HMGB1中和抗体对癫痫小鼠海马神经元凋亡相关蛋白的影响Western Blot检测发现,致痫组较正常组小鼠海马Bcl-2蛋白表达显著降低,而Bax、cleaved-caspase 3蛋白表达显著升高(P<0.01);HMGB1中和抗体处理后的癫痫小鼠与致痫组比较,Bcl-2蛋白表达明显上调,Bax和cleaved-caspase 3蛋白表达明显下调,差异有统计学意义(P<0.01)。研究结论PILO致痫小鼠海马HMGB1表达水平升高,伴随明显的细胞自噬和神经元损伤。HMGB1中和抗体能抑制过度激活的细胞自噬,减少凋亡细胞数量,保护受损的神经元。我们推测HMGB1可能成为癫痫治疗的重要靶点。第三部分:HMGB1中和抗体对癫痫小鼠空间记忆损伤的保护作用及机制研究研究目的探讨HMGB1中和抗体对PILO致痫小鼠空间记忆损伤的影响及可能的机制。研究方法1.利用腹腔注射的方法建立PILO致痫小鼠模型。选取8周龄的健康雄性小鼠,随机分为5组.:正常组(正常小鼠)、致痫组(癫痫小鼠注射PBS)、IgG组(癫痫小鼠注射IgG)和HMGB1 Ab组(癫痫小鼠注射HMGB1中和抗体)和3-MA组(癫痫小鼠注射3-MA)。2.水迷宫实验探究HMGB1中和抗体对癫痫小鼠空间记忆损伤的影响。3.Timm染色法观察海马CA3区苔藓纤维出芽(mossy fiber sprouting,MFS)情况。研究结果1.水迷宫实验发现HMGB1中和抗体能明显改善癫痫小鼠空间记忆学习能力。2.Timm染色显示致痫组和IgG组小鼠海马CA3区呈中至重度的MFS。HMGB1中和抗体处理后,MFS程度明显缓解。研究结论HMGB1中和抗体能减轻海马CA3区MFS程度,明显改善小鼠的空间记忆学习能力。HMGB1可能成为癫痫合并症治疗的重要靶点。