药物依赖是困扰全世界所有族群与阶层的普遍性社会问题。数据显示,成瘾药物的长期滥用,不仅造成机体和精神损伤,而且相当一部分服药者会因过量服用药物导致死亡,对家庭及社会都造成了严重的危害。吗啡是一种常见的阿片类药物,有报道称长期使用吗啡会诱发氧化应激,导致神经元凋亡及脑损伤。研究表明,硫化氢作为新型气体信号分子和神经调质,能够起到抗凋亡和抗氧化作用,从而减轻药物依赖所致的脑损伤。目前,吗啡成瘾机制依然存在许多尚未阐明的问题,硫化氢是否能够通过抑制氧化应激达到减轻或抑制吗啡依赖的目的,答案尚不明确。本课题建立小鼠吗啡依赖模型,探讨气体信号分子硫化氢对吗啡依赖的影响,进一步利用SH-SY5Y细胞建立吗啡诱导的氧化应激模型,探讨硫化氢抗氧化应激的作用与机制。主要研究内容与结果如下:(1)选取8-10周龄雄性C57/BL6小鼠(20-25 g),建立吗啡依赖的动物模型,小鼠随机分成三组:①对照组:注射生理盐水;②吗啡组:盐酸吗啡进行皮下注射,每天两次,间隔12小时(8:00和20:00),连续4天,每天增加剂量(20,30,40和50 mg/kg);③硫化氢+吗啡组:动物在每次注射吗啡前30分钟接受硫氢化钠(5.6 mg/kg)腹腔注射。第5天,吗啡组和硫化氢+吗啡组动物于8:00接受单次吗啡(20 mg/kg)皮下注射,4小时后所有动物接受单次腹腔纳洛酮(10 mg/kg)注射以诱导戒断行为。随后立即将每只小鼠置于丙烯酸玻璃盒中(30X30X40 cm),记录15分钟内的跳跃次数,作为吗啡戒断症状的观测指标。在注射纳洛酮之前和之后30分钟分别测量小鼠的体重。结果表明,硫化氢预处理能够显着减少纳洛酮引起的吗啡依赖小鼠戒断后跳跃次数,表明硫化氢能够缓解吗啡依赖后的戒断症状。(2)选取SH-SY5Y细胞建立吗啡诱导的氧化应激模型,分为三组:对照组、吗啡组和硫化氢+吗啡组。以2’,7’-二氯二氢荧光素二乙酸酯作为荧光探针,检测细胞内ROS水平,结果表明吗啡(25 μM和50 μM)处理24h可以引起细胞内ROS浓度上升,硫化氢(100 μM)预处理30 min可以显著降低吗啡诱导的ROS生成。同时对细胞内MDA生成及SOD活性进行测定,发现与对照组相比,吗啡能够引起细胞内的MDA含量增多和SOD活性降低,说明吗啡破坏了抗氧化酶系统的平衡,减弱了细胞保护作用,而硫化氢预处理可以显著减少细胞内MDA生成,增强SOD活性,说明硫化氢对吗啡导致的细胞氧化应激损伤有显著的保护作用。(3)为进一步检测硫化氢的抗氧化效果,采用蛋白免疫印迹技术,检测细胞内Cytochrome-C的表达水平,结果表明,吗啡暴露使得细胞内Cytochrome-C的表达升高,且呈现时间依赖性,硫化氢预处理可以显著降低Cytochrome-C的表达。随后,以JC-1和Hoechst33258作为荧光探针,分别检测线粒体膜电位变化情况和细胞凋亡程度。结果表明,吗啡暴露导致细胞线粒体膜电位丢失,发生凋亡,硫化氢预处理可以显著提升线粒体膜电位,抑制细胞凋亡。LDH检测结果表明,吗啡暴露导致LDH释放增加,增强细胞毒性,而硫化氢预处理可以显著抑制LDH释放,降低细胞毒性,起到细胞保护作用。(4)为探究硫化氢对吗啡诱导细胞氧化应激保护作用的机制,使用蛋白免疫印迹技术,检测P66Shc和Nrf2/Keap1通路蛋白的表达水平变化情况。结果发现,吗啡能够激活细胞内的Nrf2/Keap1信号通路,促进Nrf2蛋白与Keap1蛋白解偶联并入核,而硫化氢可以显著抑制该效应,表明Nrf2/Keap1信号通路参与了硫化氢抑制吗啡导致的细胞氧化应激过程。综上所述,本研究认为硫化氢能够通过抑制Nrf2/Keap1信号通路的激活来抑制吗啡诱导的氧化应激,并抑制细胞凋亡。这可能为硫化氢治疗吗啡依赖提供新思路。