论文部分内容阅读
猪的被毛颜色是品种的重要特征,也直接关系到商品猪的售价。近年来,商品瘦肉型猪生产以杜长大三元杂交猪为主体,但此繁育体系中会出现少数不受客户欢迎的杂白猪。KIT基因控制猪的显性白毛色,因此建立简便、快速检测KIT基因型的方法以淘汰非显性白毛色个体一直是近年来的研究热点。猪的显性白毛表型由KIT基因的两个突变引起:一是基因拷贝数的串联重复变异(~450kb),一是内含子17第一核苷酸G→A的剪切突变。本研究采用实时荧光定量PCR方法,借助TaqMan-MGB探针技术确定红毛杜洛克、白毛杜洛克、大白猪的KIT基因型(白毛杜洛克系红毛杜洛克与大约克猪杂交选育的被毛白色的种群)。研究分为两部分:第一部分:KIT拷贝数变异(CNV)的检测在KIT外显子2中设计MGB探针和引物,以单拷贝基因ESR作为内标基因,根据2-ΔΔCt方法定量检测KIT的拷贝数变异(CNV)。结果表明,MGB探针扩增KIT基因目的片段,不同DNA梯度浓度Ct值差异极显著(P < 0.0001),变异系数低(0.12%~0.26%);KIT与内标基因ESR的扩增效率相差只有2.4%;采用聚类分析推测了待测的50枚样品KIT的CNV分别归属于2、3、4、5、6个拷贝。6头杜洛克猪的KIT均为2拷贝,大白猪5或6个拷贝各3头,白毛杜洛克猪均为3~6拷贝。以上KIT基因拷贝数的分布符合预期值。第二部分:KIT内含子17第一位核苷酸G→A剪切突变比例的检测对剪切突变处175bp序列进行PCR扩增、纯化、测序,根据测序结果设计MGB探针对,采用实时荧光定量PCR方法检测KIT内含子17第一位核苷酸G→A剪切突变的A / (G+A)比例。结果表明,用于检测目的突变的MGB探针对具有良好的特异性、稳定性;定量扩增试验的标准曲线显示探针对对于KIT1(G)和KIT2(A)的扩增效率近似(98.8%和97.2%)。研究推定了待测样品(N = 50)目的突变的A / (G+A)比例。将两部分试验结果综合考量,将50枚待测样品推定为对应的9种KIT基因型类型,基因分型结果符合预期值,可信度高。本研究建立的TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR方法,与已报道的焦磷酸测序(pyrosequencing)、寡核苷酸连接分析法(OLA)等技术相比,具有简便、快速、特异性和稳定性好的特点,适合于普通实验室应用。