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第一部分骨髓巨噬细胞来源的外泌体通过miR-143-5p抑制MKP5表达促进肝细胞胰岛素抵抗的机制研究目的:胰岛素抵抗是导致2型糖尿病发生的主要原因之一。肝脏是人体内最大的代谢器官,是胰岛素抵抗发生的主要场所之一。肥胖是导致肝脏胰岛素抵抗的主要原因之一。研究发现,肥胖可导致肝脏内骨髓来源的巨噬细胞浸润增多。增多的巨噬细胞在肝脏胰岛素抵抗发生的过程中起到重要的作用。这一生物学过程主要由巨噬细胞分泌的外泌体介导。外泌体是直径为30-100nm的细胞囊泡,在细胞间信息交流起到了重要的作用。许多研究发现,外泌体可携带其内含物对受体细胞信号通路进行调控。本研究旨在探讨骨髓巨噬细胞来源的外泌体在肝脏胰岛素抵抗中的作用,明确骨髓巨噬细胞外泌体中何种microRNA（miRNA）调节肝脏胰岛素信号通路,揭示肝脏胰岛素抵抗的发病机制,证明骨髓巨噬细胞外泌体在2型糖尿病发病中的作用,为2型糖尿病的防治提供新思路。方法:1.以高脂饮食（High fat diet）喂养2月龄雄性C57BL/6J小鼠3个月（HFD喂养小鼠）作为肝脏胰岛素抵抗模型,以正常饮食（Chowdiet）喂养2月龄雄性C57BL/6J小鼠3个月（CD喂养小鼠）为对照组。提取并诱导得到小鼠骨髓巨噬细胞,获取其细胞培养基并通过离心法分离外泌体;2.使用real-time PCR方法检测HFD喂养小鼠和CD喂养小鼠骨髓巨噬细胞中M1和M2型的标志分子;3.用油酸和棕榈酸混合物（Oleic acid/palmitic acid,O/P 2:1）处理小鼠巨噬细胞系RAW264.7,收集巨噬细胞上清液并通过超速离心法分离外泌体;4.分别用巨噬细胞培养基上清液和外泌体处理小鼠肝脏细胞系Hep1-6,检测肝细胞中胰岛素信号通路活性和糖原合成;5.用PKH26标记外泌体并处理Hep1-6细胞,采用免疫荧光法观察外泌体是否进入肝细胞中;6.收集HFD喂养小鼠和CD喂养小鼠的骨髓巨噬细胞来源的外泌体,使用miRNA芯片对其中miRNA含量进行检测,筛选HFD喂养小鼠骨髓巨噬细胞外泌体中水平升高的miRNA;7.经芯片筛选出32个上调的miRNA,进一步用real-time PCR验证芯片结果,发现miR-143-5p在HFD喂养小鼠骨髓巨噬细胞外泌体中的水平明显增加;8.用HFD喂养小鼠骨髓巨噬细胞的上清液和外泌体处理Hep1-6细胞,检测Htep1-6细胞中miR-143-5p的水平;9.在Hep1-6细胞中转染miR-143-5p mimics,检测miR-143-5p水平、AKT/GSK信号通路活性以及糖原水平;10.用生物信息学软件预测miR-143-5p的下游靶基因,并以双荧光素酶报告实验和Western blot方法证明miR-143-5p下游靶基因;11.在Hep1-6细胞中共转染miR-143-5p mimics及其靶基因过表达质粒,检测miR-143-5p水平、AKT/GSK信号通路活性以及糖原水平。结果:1.HFD喂养小鼠肝脏内AKT/GSK信号通路活性受损、糖原合成降低,肝脏内巨噬细胞浸润明显增加;2.与CD喂养小鼠相比,HFD喂养小鼠骨髓巨噬细胞向M1型极化,M1型标志分子如Tnf-α、Il-6mRAN水平升高,M2型标志分子如Arginase1、Cd206和Il-10 mRAN水平降低;3.经过超速离心分离小鼠骨髓巨噬细胞和RAW264.7细胞的外泌体,通过电镜观察其大小为30-100nm,并表达外泌体表面标志分子如Flotillin-1（FLOT1）、CD63和CD9;4.用PKH26标记巨噬细胞外泌体,处理Hep1-6细胞后观察肝细胞中红色荧光,结果显示巨噬细胞外泌体可进入肝细胞;5.使用HFD喂养小鼠骨髓巨噬细胞的培养基上清液和外泌体处理Hep1-6细胞后,AKT/GSK信号通路活性受损、糖原合成降低;6.使用O/P诱导RAW264.7细胞的培养基上清液和外泌体处理Hep1-6细胞后,AKT/GSK信号通路活性受损、糖原合成降低;7.miRNA芯片和real-time PCR结果均显示HFD喂养小鼠骨髓巨噬细胞外泌体中miR-143-5p水平升高;8.HFD喂养小鼠骨髓巨噬细胞的上清液和外泌体均可使Hep1-6细胞中miR-143-5p水平显著上升;9.在Hep1-6细胞中过表达miR-143-5p可引起胰岛素信号通路活性受损和糖原合成降低;10.双荧光素酶报告实验和Western blot结果证明丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶5（mitogen activated protein kinase phosphatase,Mkp5）是 miR-143-5p 下游靶基因;11.过表达MKP5能够逆转miR-143-5p mimics对胰岛素信号通路的影响。结论:1.HFD喂养小鼠产生肝脏胰岛素抵抗并伴随着肝脏内巨噬细胞浸润增多;2.HFD喂养小鼠的骨髓巨噬细胞呈现M1型极化;3.HFD喂养小鼠骨髓巨噬细胞和O/P处理RAW264.7细胞的外泌体均可抑制肝细胞胰岛素信号通路活性;4.HFD喂养小鼠骨髓巨噬细胞来源的外泌体可携带miR-143-5p进入肝细胞并调节其胰岛素信号通路;5.过表达miR-143-5p可抑制肝细胞中胰岛素信号通路活性和糖原合成;6.MiR-143-5p通过调控靶基因Mkp5影响肝细胞中AKT/GSK信号通路。第二部分MiR-23a/b-3p调节小鼠肝细胞甘油三酯蓄积的机制研究目的:代谢相关脂肪性肝病是指以肝脏脂质蓄积为主要特征的肝脏代谢疾病。其中,肝脏甘油三酯蓄积是代谢相关脂肪性肝病最重要的病理表现,所以研究肝脏内甘油三酯蓄积的分子机制具有十分重要的意义。MiRNA是一类长度由22个核苷酸组成的不具有编码作用的RNA。它通过调控下游靶基因参与调节生物体重要的生理功能。目前已知多种miRNA能够调节肝细胞甘油三酯代谢。MiR-23a/b-3p是miR-23～27～24-2超家族的成员。研究证明miR-23a/b-3p参与癌症和神经系统疾病的发病,然而其在肝脏甘油三酯蓄积中的作用尚未见报道。本研究旨在阐明miR-23a/b-3p调节小鼠肝细胞甘油三酯蓄积的作用及其机制,为代谢相关脂肪性肝病的防治拓展了研究方向。方法:1.高脂喂养2月龄雄性C57BL/6J小鼠3个月建立代谢相关脂肪性肝病模型。利用real-time PCR方法检测小鼠肝脏内miR-23a/b-3p水平和脂质合成相关基因Srebp-1c和Fas mRNA表达水平,以Western blot检测脂质合成相关基因Srebp-1c和Fas蛋白表达水平:2.用O/P处理小鼠肝细胞系Hep1-6 24 h建立肝细胞甘油三脂蓄积模型,检测miR-23a/b-3p、脂质合成相关基因Srebp-1c和Fas的表达水平;3.在小鼠肝脏细胞系Hep1-6中分别转染miR-23a/b-3p mimics或inhibitors 48 h,分析miR-23a/b-3p表达水平、脂质合成相关基因Srebp-1c和Fas表达水平及甘油三酯含量;4.利用生物信息学软件和双荧光素酶报告实验分析Srebp-1c和Fas mRNA 5’-UTR是否具有miR-23a/b-3p结合位点;5.在Hep1-6细胞中转染miR-23a/b-3p mimics48 h后给予放线菌素D（ActD）处理,并在0h、3h、6h和9h时检测Srebp-1c和Fas mRNA水平;6.在Hep1-6细胞中共转染SREBP-1c和FAS siRNA及miR-23a/b-3p mimics,检测脂质合成相关基因Srebp-1c和Fas的表达水平及甘油三酯含量。结果:1.以高脂喂养雄性C57BL/6J小鼠12周成功构建代谢相关脂肪性肝病模型,肝脏中甘油三酯蓄积增多,miR-23a/b-3p水平升高,脂质合成相关基因Srebp-1c和Fas蛋白水平上调;2.O/P处理Hep1-6细胞24 h后,细胞中脂质蓄积增多;miR-23a/b-3p水平、SREBP-1和FAS蛋白水平均升高;3.在Hep1-6细胞中转染miR-23a/b-3p mimics 48 h,脂质合成相关基因Srebp-1c和Fas的mRNA及蛋白水平均升高,细胞中甘油三脂蓄积增加。相反,在Hep1-6细胞中转染miR-23a/b-3p inhibitors 48 h,脂质合成相关基因Srebp-1c和Fas的表达水平降低,细胞中甘油三脂蓄积减少;4.生物信息学软件和双荧光素酶报告实验结果显示,Srebp-1c和Fas mRNA 5’端具有miR-23a/b-3p结合位点,提示miR-23a/b-3p能够同Srebp-1c和Fas mRNA 5’-UTR结合并增强其mRNA稳定性;5.在Hep1-6细胞中转染miR-23a/b-3p mimics 48 h 后给予放线菌素 D（ActD）处理,0h、3h、6h 和 9h时Srebp-1c和FasmRNA的稳定性增强;6.抑制SREBP-1c和FAS表达可改善miR-23a/b-3p诱导的脂质蓄积。结论:1.在HFD喂养小鼠模型肝脏中,miR-23a-3p和miR-23b-3p表达升高;2.O/P处理Hep1-6细胞显著上调miR-23a/b-3p水平,促进细胞内甘油三酯蓄积;3.过表达miR-23a/b-3p能够上调Hep1-6细胞中脂质合成相关基因如Srebp-1c和Fas的表达,促进细胞内甘油三酯蓄积;4.在Hep1-6细胞中低表达miR-23a/b-3p可以逆转O/P诱导的甘油三酯蓄积;5.MiR-23a/b-3p通过与Srebp-1c和Fas mRNA的5’UTR结合,增强其mRNA稳定性进而促进肝细胞甘油三酯蓄积。