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目的:本课题是国家自然科学基金项目“基于冰冻切片-显微切割-液质联用的牛蒡子药材发育过程牛蒡苷积累规律研究（81773852）”的一部分。为了解牛蒡生长发育过程中化学成分动态积累规律,本研究对五个不同生长时期及干燥的牛蒡果实,不同萌发时期的牛蒡中的牛蒡苷及牛蒡苷元进行含量测定;对五个不同生长时期牛蒡果实和种仁中化学成分进行鉴定和差异比较;旨在明确牛蒡生长发育过程中化学成分动态积累规律,为牛蒡果实中牛蒡苷等化学成分生合成机制、牛蒡子采收期的确定和牛蒡的植物保护等研究提供理论参考。对牛蒡植物进行转录组测序和分析,并结合不同生长时期牛蒡果实中牛蒡苷及牛蒡苷元含量积累特征和牛蒡的基因数据,对牛蒡中牛蒡苷及牛蒡苷元生合成相关候选基因进行分析,为牛蒡苷及牛蒡苷元的生物合成研究提供参考,并为牛蒡的分子生物学和遗传功能分析提供宝贵的资源。材料与方法:1材料:取五个不同生长时期（花蕾期、初花期、盛花期、花末期、成熟期）牛蒡果实,取同年采收干燥成熟的牛蒡果实。所有牛蒡果实于2018年9月,2019年6月至9月采自辽宁中医药大学大连校区（辽宁省药用植物重点物种保存圃,N39°06′18″,E121°87′62″）。2方法:2.1通过查阅《中国植物志》、Flora of China、the Plant List等相关资料与网站,对牛蒡属植物分类进行整理,同时对牛蒡属植物的相关生物活性、化学多样性和分子生物学研究进行总结。2.2通过高效液相色谱法（HPLC）对不同生长时期牛蒡果实及不同萌发时期牛蒡进行含量测定研究,了解牛蒡生长发育过程中,牛蒡苷及牛蒡苷元成分动态积累规律。2.3实验采用超高效液相色谱联用-四级杆串联飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF-MS）鉴定五个不同生长时期的牛蒡果实和种仁中化学成分,比较不同样品中各化合物的选择离子响应强度,实现对五个不同生长时期的牛蒡果实和种仁中的主要有效成分结构推测及其相对含量差异这两个研究目标。2.4对同株牛蒡的花蕾期果实、初花期果实、盛花期果实、花末期果实、成熟期果实、叶、茎、花被、叶柄和根进行RNA提取和文库构建,转录组测序及组装。将Unigene与NR,NT,Swiss-Prot,KEGG,COG,GO进行blastx比对,并分别对注释到每个库以及所有注释上的unigenes数目进行统计。将组装出来unigenes作为参考序列,通过SSR软件Micro SAtellite（MISA）找出所有的SSR。同时还对牛蒡不同样本进行转录组差异性分析,了解差异基因的生物功能归属。2.5总结木脂素类生合成途径研究,对牛蒡苷生合成相关酶进行筛选。运用拟南芥蛋白序列和其他进缘菊科植物对牛蒡基因组蛋白文件进行blast比对,应用Pfam＿scan搜索蛋白是否含有对应结构域。对牛蒡中牛蒡苷及牛蒡苷元生合成途径中可能相关代谢的12种相关酶基因进行相关性分析。结果:1目前,从牛蒡属植物中分离得到多种化合物,包括木脂素、萜类化合物、类黄酮、酚类、内酯类、炔类和多糖等,这些化合物分布在不同植物部位,其中木脂素是牛蒡属中最具特征的成分。牛蒡作为牛蒡属中最常用的药用植物,具有解热、抗菌、利尿、降血糖、抗氧化、抗炎、抗肝毒性、抗溃疡和抗肿瘤活性等药理活性。2在前三个生长时期的牛蒡果实中牛蒡苷与牛蒡苷元微量积累,花末期生成大量牛蒡苷元,少量牛蒡苷,此时牛蒡苷元为主要成分;而在成熟期时,牛蒡果实中牛蒡苷大量积累,牛蒡苷元含量减少,此时牛蒡苷为主要成分且含量远远大于牛蒡苷元。牛蒡在萌发过程中,随着时间增长牛蒡苷含量减少,牛蒡苷元含量增加,萌发15天时,牛蒡苷元含量高于牛蒡苷。3从五个不同生长时期牛蒡果实样品中共鉴定出31个化合物,鉴定的成分按结构类型分类,包括氨基酸（2个）、黄酮类（1个）、酚酸类（7个,其中含6个苯丙素类酚酸）及木脂素类（21个）。其中花蕾期果实鉴定得到20个化合物,初花期与盛花期果实鉴定得到相同的17个化合物,花末期果实鉴定得到28个化合物,成熟期牛蒡果实中成分种类最多,包含所有31个化合物。五个不同生长时期牛蒡种仁中共观察到33个主要色谱峰,鉴定了其中32个的可能结构。鉴定出来的成分中,包括氨基酸类（1个）、酚酸类（8个）及木脂素类（19个）、脂肪酸类（4个）;其中初花期和花蕾期种仁均鉴定到26个化合物,盛花期种仁鉴定到29个化合物,花末期种仁鉴定到32个化合物,成熟期牛蒡种仁中成分种类最多,包含所有33个化合物。4利用Illumina Hi Seq TM 2500测序平台进行牛蒡转录组测序,获得474 950 882条clean reads,从头组装总共产生了161 596个unigenes。获得注释的unigenes共100834条,在NR,NT,Swiss-Prot,KEGG,COG,GO数据库获得注释的unigenes数目依次为93 853（58.08%）、77 118（47.72%）、64 270（39.77%）、60 057（37.16%）、43 841（27.13%）、70 477（43.61%）条。被注释到生物过程、细胞组成、分子功能3个GO类别的56个分支。利用公共数据库进行同源比对,60 057个unigenes注释到128个代谢途径中,7 180个基因被注释到次生代谢产物的生物合成,其中387个基因参与苯丙氨酸代谢,868个基因参与了苯丙烷的生物合成。识别得到的SSR总数为33 002,包含SSR的序列数目为26 254条,其中有5252条unigenes含有1个以上的SSR位点。SSR位点出现频率为20.4%。5在牛蒡中比对得到4-香豆酸-CoA连接酶（4-coumarate-CoA ligase,4CL）8个,肉桂酸-4-羟化酶（cinnamate-4-hydroxylase,C4H）2个、咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶（caffeoyl-Co A O-methyltransferase,CCo AOMT）6个、肉桂酰辅酶A还原酶（cinnamoyl-Co A reductase,CCR）2个、苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase,PAL）5个、对-香豆酸3-羟化酶（coumarate3-hydroxylase,C3H）2个、肉桂醇脱氢酶（cinnamyl alcohol dehydrogenase,CAD）8个、咖啡酸-O-甲基转移酶（caffeic acid/5-hydroxy-ferulic acid O-methytransferase,COMT）5个、同化蛋白氧化酶（dirigent protein,DIR）3个、羟基肉桂酰转移酶（hydroxycinnamoyl transferase,HCT）5个、松脂酚-落叶松树脂酚还原酶（pinoresinol/lariciresinol reductase,PLR）3个、开环异落叶松脂醇脱氢酶（secoisolariciresinol dehydrogenase,SIRD）6个。根据牛蒡苷含量和相关基因表达计算Pearson相关系数（cor>0.7,P<0.05）。结果显示一个4CL（ID:evm.model.000137F.68）基因,一个DIR（ID:evm.model.000171F.169）基因和一个HCT（ID:evm.model.000054F.303）基因与牛蒡苷生合成高度相关。结论:1对牛蒡属植物的相关生物活性、化学多样性和分子生物学研究进行总结。研究为牛蒡属植物的药理活性、临床应用、生物合成代谢等进一步开发合理应用提供依据。2在花末期牛蒡果实中牛蒡苷元为主要化学成分,含量高于牛蒡苷。在成熟期牛蒡果实中牛蒡苷为主要化学成分且含量高达11.72%,牛蒡苷元含量较花末期明显减少。随着牛蒡生长牛蒡苷及牛蒡苷元含量变化趋势,可以推测随着牛蒡成熟牛蒡苷元转化为牛蒡苷。同年采收的干燥牛蒡果实中牛蒡苷含量为8.591%,高于2020版《中国药典》的规定“牛蒡苷含量不得低于5%”。随萌发时间增加牛蒡苷含量减少,牛蒡苷元含量增加。在萌发15天时,牛蒡苷元含量已经大于牛蒡苷含量,结果完全与牛蒡果实生长时期积累情况相反。3通过UPLC-Q-TOF-MS技术对五个不同生长时期牛蒡果实和种仁进行化合物鉴定研究,结果得到31个成分,包括氨基酸、黄酮类、酚酸类及木脂素类。五个不同生长牛蒡种仁中共观察到33个主要色谱峰,鉴定了其中32个的可能结构,主要为氨基酸、酚酸（绿原酸等咖啡酸衍生物）、木脂素类成分及脂肪酸类成份。其中牛蒡苷及牛蒡苷元作为牛蒡子的主要药理成分及质量标志性成分均在五个不同时期的果实和种仁中被鉴定到。4利用转录组测序技术获得牛蒡转录组数据,为后期牛蒡基因功能鉴定、次生代谢途径解析及其调控机制研究奠定基础。分析得到的简单重复序列（SSR）位点信息,为开发分子标记奠定基础。5通过总结木脂素类生合成途径研究,得到牛蒡果实中牛蒡苷及牛蒡苷元可能生合成途径;在对牛蒡果实中牛蒡苷及牛蒡苷元生合成途径中可能相关代谢的相关酶基因进行相关性分析中,得到一个4CL基因,一个DIR基因和HCT基因与牛蒡苷生合成高度相关。这些数据为研究牛蒡苷和牛蒡苷元的合成途径提供参考,为牛蒡生物学研究提供了宝贵的资源。