靛蓝是一种重要的色素，它广泛应用于印染、医药和食品工业。近年来，利用生物法制备靛蓝已经引起了相关研究者的重视，这对解决化学合成靛蓝所带来的环境污染问题具有重大意义。本文利用能表达P450 BM3的重组大肠杆菌催化吲哚制备靛蓝，研究了游离细胞和固定化细胞催化的反应特性。构建了能共表达P450 BM3和葡萄糖脱氢酶的重组菌，解决了P450 BM3催化反应的辅酶再生问题。以该重组菌作为还原型辅酶NADPH的再生系统，研究了其催化吲哚制备靛蓝的反应特性。第一，针对P450 BM3在重组菌中的表达量很低，不能很好地满足反应的需要，采用Plackett-Burman设计和杂合设计相结合对重组E.coliBL21（pET28a（+）-P450 BM3）表达P450 BM3的发酵条件进行了优化。先用Plackett-Burman设计，从众多影响重组菌表达P450 BM3的因素中有效地筛选出了最为重要的因素，再用响应面法进行了优化，得到了较佳表达条件。通过优化，P450 BM3酶活从37.6×10^-3 U／ml提高到了57.9×10^-3 U／ml。优化结果与实际实验结果吻合较好。第二，采用重组E.coli BL21（pET28a（+）-P450 BM3）细胞制备靛蓝，考察了实验中各反应条件对重组菌细胞进行催化反应的影响。结果表明，pH 7.0-7.5，温度35℃，底物浓度0.5 mmol／L为较好的反应条件。在此条件下，反应进行8 h后，靛蓝收率可以达到29.43％；加入5 g／L葡萄糖时，可以将靛蓝收率提高到44.08％；高浓度的底物和产物对合成反应具有一定的抑制作用。在此基础上，进一步考察了辅酶再生对重组E.coli BL21（pET28a（+）-P450 BM3）细胞催化吲哚制备靛蓝的反应的影响，结果表明，在反应体系中加入NADP⁺和葡萄糖脱氢酶，能有效地促进NADPH再生，使反应得以持续进行。第三，采用了海藻酸钙胶囊化重组E．coli BL21（pET28a（+）-P450 BM3）细胞催化吲哚制备靛蓝。考察了固定化条件对反应的影响，实验发现，海藻酸钠浓度为1.0％（w／v），CaCl₂浓度为2％（w／v），凝胶反应时间为6 min时，可以得到较高的靛蓝收率。考察了固定化细胞催化的反应特性，发现固定化重组菌细胞催化吲哚制备靛蓝的最适反应温度和最适pH分别为35℃和pH 7.5；当底物浓度为0.5mmol／L时靛蓝收率最高。但同样存在与E.coli BL21（pET28a（+）-P450 BM3）游离细胞相类似的问题，即在过高浓度底物存在时对细胞催化的抑制作用。固定化大大提高了重组菌的热稳定性，固定化细胞连续进行5批次催化反应后，靛蓝收率并没有明显变化。第四，为了解决辅酶再生问题，构建了能共表达P450 BM3和葡萄糖脱氢酶的重组E.coli BL21（pET28a（+）-P450 BM3-gdh0310）。对该重组菌表达P450 BM3和葡萄糖脱氢酶的条件进行了优化，P450 BM3和葡萄糖脱氢酶的比酶活分别可达8173.13 U／mg protein和0.045 U／mg protein。第五，在优化的基础上对重组E.coli BL21（pET28a（+）-P450 BM3-gdh0310）催化辅酶再生的能力进行了考察，结果发现该重组菌在催化吲哚制备靛蓝的反应过程中，在不添加额外的辅酶和葡萄糖脱氢酶的情况下，细胞能够完成吲哚到靛蓝的高效催化。同时还研究了重组E.coli BL21（pET28a（+）-P450 BM3-gdh0310）催化吲哚制备靛蓝的反应特性。结果表明，吲哚浓度为5 mmol／L，葡萄糖浓度为100mmol／L，重组菌于35℃、100 r／min的条件下具有最高的催化效率。通过分批加入底物的方式，能有效解除底物的抑制作用。五次加入吲哚共13 mmol／L，反应进行到24 h，收率仍可达80％以上，反应液中最终靛蓝浓度可达4.71 mmol／L（1235.2 mg／L）。第六，分别对有辅酶参与的P450 BM3和葡萄糖脱氢酶催化双底物的酶促动力学进行了初步研究。采用有序反应机制，得到了P450 BM3和葡萄糖脱氢酶的酶促动力学方程。在两个酶的动力学方程基础上，建立了描述双酶催化体系辅酶变化的函数：d[NADPH]／dt=V_GDH-V_{p450 BM3}d[NADP⁺]／dt=-V_GDH+V_{P450 BM3}利用所得的方程对实验数据进行了拟合，该方程能较好地描述反应过程中辅酶浓度随时间的变化趋势。