近年来对兰州大尾羊研究主要集中在种群生态学、遗传多样性、繁殖学等方面,这些研究结果可反映兰州大尾羊遗传多样性丰富程度和确定品种遗传独特性程度,与其他绵阳品种间的亲缘关系,起源和遗传分化情况,最终区分绵羊品种或类型。虽然目前的研究在种质资源的保护和发展、尾部脂肪细胞发育性变化、血液蛋白多态性等方面比较完善,但在脂肪代谢候选基因与其尾部脂肪沉积相关性以及表达规律等方面缺乏较为系统的研究,从而导致在兰州大尾羊的尾脂沉积因素等方面缺乏分子水平上的依据。MAPK、PPARG、HSL、DGAT是有关脂肪代谢功能的重要候选基因。因此,克隆兰州大尾羊PPARG、MAPK13基因,分析其序列及其编码蛋白的生物学特性,并进行原核表达,对研究绵羊PPARG、MAPK13基因的功能和生产应用具有重要意义。兰州大尾羊(Lanzhou fat-tailed sheep)是清朝同治年间(1862-1875)由陕西大荔一带引进的同羊与兰州当地蒙古羊杂交选育而成的地方绵羊品种,因其尾部脂肪过度沉积,导致尾大、脂肪充实而得名。过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptor, PPAR)是调节目标基因表达的核内受体转录因子超家族成员。PPAR分子量在54kDa左右,主要表达于免疫系统和脂肪组织,是胰岛素增敏剂噻唑烷二酮类药物作用的靶分子,与机体免疫、胰岛素抵抗、脂肪细胞分化关系密切。PPAR按结构分为a、β、γ三种类型,PPARG基因(Y型)是脂肪细胞分化的主要候选基因。促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)链是真核生物信号传递网络中的重要途径之一。MAPK通路主要包括ERK.p38MARK和JNK三条途径,主要作用于脂肪细胞组织中,其逐级磷酸化过程涉及成脂分化的调控,与胰岛素抵抗、脂肪细胞分化密切相关。p38delta MAPK也称为MAPK13,是脂肪细胞分化的主要候选基因。本研究根据绵羊PPARG、MAPK13基因CDS序列设计特异引物,利用RACE和RT-PCR技术克隆获得兰州大尾羊PPARG、MAPK13基因全长序列,并结合生物信息学方法分析其生物学特性。结果表明,克隆获得兰州大尾羊PPARG基因cDNA序列全长1774bp(GenBank序列号：KF727439),其CDS区片段长1428bp,编码475个氨基酸,编码区两侧翼分别具有5’-UTR131bp (1-131nt)和3’-UTR214bp (1560-1774nt)。预测兰州大尾羊PPARG蛋白分子量为54.40kDa,理论等电点为4.94。预测PPARG基因编码蛋白疏水性最大值为3.600,最小值为-2.744,为非跨膜的疏水性蛋白。亚细胞定位主要在细胞质(65.2%)和细胞核(21.7%)中,少量作用于细胞支架(4.3%)和过氧化物酶体(4.3%),无信号肽,不属于分泌蛋白。预测其氨基酸序列有26个磷酸化位点,无糖基化位点,含有1个ZnF C4结构域、1个HOLI结构域和1个LCR结构域,二级结构以随机卷曲为主。同源性分析显示兰州大尾羊PPARG基因核苷酸序列与山羊、野牛、水牛、绵羊、虎鲸、野猪和人类核苷酸序列间的同源性分别为99%、98%、97%、99%、94%、92%和90%,兰州大尾羊PPARG氨基酸序列与山羊、野牛、水牛、绵羊、虎鲸、野猪和人类核苷酸序列间的同源性分别为100%、99.8%、100%、100%、98.7%、98.5%和97.5%。系统发育树表明,兰州大尾羊与山羊、绵羊和水牛的进化水平更为接近,与鱼类、人类和鼠类较远。其基因第486位发生碱基转换(C←→T),第828位发生碱基颠换(C←→A),但其所编码氨基酸不变。克隆获得兰州大尾羊MAPK13基因cDNA序列全长1397bp,其CDS区片段长1102bp,编码367个氨基酸。预测兰州大尾羊MAPK13蛋白分子量为42.29kDa,理论等电点为8.82,为非跨膜的疏水性蛋白,亚细胞定位主要在细胞质中,无信号肽,不属于分泌蛋白。预测其氨基酸序列有19个磷酸化位点,3个糖基化位点,3个磷酸化功能结构域,4个其他结构域,1个LCR片段,二级结构以α-螺旋为主。同源性分析显示兰州大尾羊MAPK13基因序列与大多数哺乳动物相似,其第852位发生碱基颠换(C←→A),该位点编码第265位氨基酸发生变化(S←→T),同时,第951位发生碱基颠换(G←→T),但其所编码氨基酸不变。构建的基因进化树分析结果显示兰州大尾羊与牛亲缘关系最近。分别构建蛋白表达质粒pET32a-PPARG和pET32a-MAPK13,导入BL21感受态细胞后IPTG诱导表达,将表达产物进行SDS-PAGE电泳,结果显示,两个基因的蛋白均在沉淀中表达,符合上述中PPARG和MAPK13均为不分泌蛋白的预测。分析可知,兰州大尾羊与其他物种PPARG、MAPK13基因在结构上相似性较高,说明该基因具有高度的保守性。推测PPARG蛋白大部分在游离核糖体上合成,其功能与过氧化物酶体有关,该预测结果符合其过氧化物酶体增殖物激活受体的身份。PPARG氨基酸序列有26个可以成为蛋白质激酶磷酸化的位点,某些位点被磷酸化后,可导致一系列肥胖相关基因的功能失调和表达变化,如胰岛素增敏激素,脂联素(adiponectin)的表达减少。其序列包含的ZnF C4锌指结构域具有与脂质结合的功能,HOLI即LBD配体结构域在激素信号转导过程中发挥重要作用,其中PPARG锌指结构域中的磷酸化位点Ser112,被MAPK磷酸化后,可以抑制PPARG同配体的结合,从而降低PPARG蛋白的活性,两个结构域均与成脂分化过程相关联。兰州大尾羊MAPK13序列包含的S_TKc结构域可将ATP的γ磷酰基转移到蛋白质丝氨酸／苏氨酸残基上,导致一系列肥胖相关基因的功能失调和表达变化。综合上述,为进一步研究PPARG、MAPK13基因与成脂分化过程的相关性提供了参考。