随着比较免疫学的迅速发展，以及美国文昌鱼全基因组测序的完成，又由于TLR与TNF系统在进化过程中表现出众多的物种特异性。文昌鱼作为由无脊椎动物到脊椎动物进化的代表，成为解释这两个信号网络演化的关键所在。因此，本论文以文昌鱼的TLR与TNF信号通路为研究对象，通过比较基因组，各种免疫生物学检测手段得到以下几方面的研究结果： 1.文昌鱼中存在一个全新的TLR系统，包括数十个TLR受体和数十个的TIR接头分子。本论文选取其中最具代表性的BbtTLR1与BbtMyD88进行功能研究，研究表明BbtTLR1是由文昌鱼特有的反转录插入事件插入到PSMB7/10的内含子中产生的，是文昌鱼TLR家族的一个典型代表。该基因对细菌感染，尤其是革兰氏阴性菌的感染有明显作用。我们还发现BbtTLR1能够增强BbtMyD88对NF-κ与AP-1的激活作用，这表明了V-type TLR-MyD88-NF-κB/AP-1信号通路在文昌鱼中已经建立，这是首次在脊椎动物以外报道该信号通路的存在。除此之外，我们还证明了无论是BbtTLR1还是BbtMyD88都不能激活IFN-β信号通路，再加上文昌鱼不具备TLR7/8/9，IRF3/7等的直系同源基因，我们推测TLR-MyD88-IFN-β信号通路是在无脊椎动物向脊椎动物分化后才出现。 2.文昌鱼拥有发达且特异的TNF信号网络，包括24个TNF配体，36个TNF受体，24个TRAF接头分子，以及数百个含有死亡结构域的接头分子。基因组纵向比较表明文昌鱼10个TRAIL-like基因是通过随机复制所得，并且该信号通路的雏形首次在文昌鱼中形成。我们从青岛文昌鱼中克隆得到五个TRAIL-like分子，尽管它们具有高度的序列同源性(50-80％不等)，但却分布在文昌鱼不同组织中，在抗感染过程中也扮演着不同的角色。除了配体的多样性之外，我们还发现TRAIL的受体在文昌鱼中不仅以多基因的形式存在，还存在多剪接体的方式。我们推测TRAIL信号通路在文昌鱼抗感染过程和凋亡过程中发挥重要的作用，并且它自身同时存在着一个完善的自我调控机制。 　　3.我们从青岛文昌鱼中克隆得到一个独立进化的死亡受体BbtDR1，序列分析表明它是由FADD的死亡结构域与TNF受体的CRD结构域重组而来，并且在文昌鱼中以单拷贝的形式存在。由于序列保守性差，单独在293T细胞中表达BbtDR1并不能诱导细胞的凋亡，虽然它能正常的表达在细胞膜表面。我们进一步从文昌鱼中克隆得到两个FADD分子，命名为BbtFADD1和BbtFADD2。Southern杂交印证FADD分子在文昌鱼基因组中的复杂性。初步研究BbtFADD1能通过其死亡结构域与BbtDR1的死亡结构域相互作用，而BbtFADD2则不能。这表明基因组随机复制产生的某些死亡结构域蛋白，在文昌鱼中并未获得确切的功能，而获得功能者将随着进化历程被固定下来。同时，这种相互作用也表明死亡受体通过FADD诱导凋亡的信号通路在文昌鱼中已经建立，这是首次在无脊椎动物中确立该信号通路，对阐明TNF诱导凋亡的信号通路进化过程有着承上启下的作用。 4.除了受体的多样性之外，文昌鱼还存在一个庞大的TRAF家族，包括1个TRAF4，1个TRAF6，4个TRAF3以及十几个TRAF1/2分子。研究表明BbtTRAF6在自身三聚化的情况下，通过其Ring finger和Zinc finger结构域激活NF-κB与JNK信号通路，并且这种激活作用能够被BbtTRAF4所抑制。TRAF4单独可以微弱的激活NF-κB，却不能激活JNK信号通路。BbtTRAF2a，BbtTRAF3a不能激活任一个信号通路，但BbtTRAF3a能够与BbtTNFR1的胞内区相互作用。除此之外，本论文还在文昌鱼中确立了TNFR1-TRAF6-NF-κB信号通路。基于对文昌鱼TRAF家族功能的分析，我们进行了横纵向比较，得出TRAF家族的复制，功能的扩增以及双接头分子的出现，对脊椎动物TLR与TNF信号网络的协同进化有着至关重要的作用的，这是首次贯穿整个生物进化历程对TRAF家族的全面分析，也是首次提出了TNF与TLR信号网络协同进化的概念。 5.从青岛文昌鱼中克隆得到BbtMyD88-NF-κB和BbtTRAF6-NF-κB信号通路中另外两个关键分子：BbtlκB与BbtκB-ras。序列分析表明BbtlκB在基因组上是以单拷贝的形式存在，是IκB家族的一个新成员，该基因在文昌鱼神经系统的发育和幼虫时期直到成体阶段的免疫防御过程有重要的作用。并且在293T细胞中能够抑制NF-κB的活性，是文昌鱼BbtMyD88，BbtTRAF6信号通路中下游的一个关键基因。BbtκB-ras是一个典型的GTPases分子，在文昌鱼基因组中以双拷贝的形式存在，这两个拷贝在无脊椎动物与脊椎动物分化后，成为脊椎动物κB-rasl与κB-ras2。表达谱分析表明，在LPS刺激下，文昌鱼κB-ras与BbtIκB有相似的表达谱，暗示了它们之间相互作用后成为文昌鱼NF-κB信号通路的负调节因子。本论文首次对文昌鱼TLR与TNF进行系统的功能分析，表明尽管文昌鱼缺乏典型的脊椎动物适应性免疫系统，它依然具有有效且特异的防御机制。同时，本论文首次在文昌鱼了确立了 V-type TLR-MyD88-IκB-NF-κB，TNFR1-TRAF6-IκB-NF-κB以及Death receptor-FADD-apoptosis这三条信号通路。这三条信号通路都是首次在无脊椎动物中被发现，表明了文昌鱼已经为脊椎动物TLR与TNF这两个复杂的信号网络做好了充分的准备。总而言之，我们的研究为全面地阐明脊椎动物TLR与TNF信号网络的协同进化提供了承上启下的信息。