背景:1893年,有学者首次报道了使用自体脂肪移植术来修复自体软组织缺陷。但其存在的移植后受区的高吸收率,是困扰医生与患者的一个重大难题。移植后部分的脂肪组织坏死液化,可能是导致自体脂肪移植高吸收率的主要原因。如此高的吸收率,导致需要进行多次自体脂肪移植术,患者承受多次痛苦和再次高消费,脂肪供区凹凸不平,发病率和不适感增高的可能性等问题。所以,为了解决这一难题,寻找一种能够长期保存自体脂肪的方法,对医生和患者而言,都是不可或缺的。自1990年Forunier提出了脂肪组织冻存的概念以来,众多学者进行了一系列关于自体冷冻脂肪的实验和临床研究。包括脂肪组织、脂肪细胞和脂肪干细胞的冷冻保存。而且有研究报道,冷冻脂肪的移植相较新鲜脂肪移植而言,术后受区的水肿和淤青更不明显。也有关于脂肪冷冻前进行脂肪获取方法的优化;脂肪冷冻时控制冷冻速率并加入冷冻保护剂;在﹣20℃的常用冷冻温度下,也使用-80℃以及液氮温度(﹣196℃)下保存脂肪等报道。但是由于常用的冷冻保护剂存在移除困难和部分冷冻保护剂有一定毒性的特点,临床上添加了冷冻保护剂保存的脂肪,几乎没有将其运用于人自体脂肪移植术的报道。有报道称,在温度为-20℃,且不控制其冷冻速率而且不使用冷冻保护剂的情况下冷冻脂肪组织时,产生的冷冻损伤是很少的,通过复温后,仍然发现了活的脂肪组织,并且在临床上也得到了应用。近10年来,国内外的学者做了大量关于冷冻脂肪组织的研究和冷冻方法的优化。诸多有差异甚至相反的观点都可以在文献中找到,且并没有对冷冻脂肪方法形成一个标准化的理论。而目前国内外关于离心纯化人颗粒脂肪组织在常用冷冻低温不同冷冻时间保存下脂肪细胞存活率的实验研究还鲜见报道。目的:本次研究将人颗粒脂肪组织与生理盐水混合液在提纯和离心后,置于常用冰箱(﹣20℃)中,冻存不同时间后观察分析复温后脂肪组织的的细胞代谢改变、细胞活力等方面,初步探讨在常用冷冻低温保存下脂肪的细胞存活率变化,为冷冻脂肪的进一步优化以及标准化,提供相关理论参考和基础性的实验依据。方法:抽取获得经离心纯化后的人脂肪组织颗粒,直接置于-20℃冰箱中冻存1个月、2个月、3个月、6个月、9个月、12个月、24个月复温后取出与新鲜脂肪组织作对比,复温后观察脂肪组织颗粒的形态体积变化,组织石蜡包埋切片he染色观察细胞结构是否完整,台盼蓝拒染实验测定脂肪组织颗粒存活率,组织冰冻切片油红o染色观察脂肪细胞中脂滴形态,流式细胞术分析细胞凋亡率,葡萄糖转移量法测定细胞活性。结果:脂肪组织颗粒形态学观察显示,经冻存复温后的脂肪组织颗粒随冻存时间的延长,颜色由鲜黄色逐渐变淡,油脂杂质逐渐增多。he染色显示,冻存1、2个月后的脂肪组织颗粒,组织细胞结构清晰完整,与新鲜脂肪形态上无明显差异。冻存3、6、9个月后的脂肪组织颗粒,虽然存在一定的组织细胞结构,但细胞数量和质量逐渐降低。冻存时间为12、24个月后,组织细胞形态和结构已严重破坏。台盼蓝染色经细胞计数仪定量分析后,结果显示:与新鲜脂肪组织颗粒相比较,脂肪组织颗粒随着冻存时间的增加,存活率逐渐降低;在冻存1、2个月之后存活率下降的均不明显,与对照组之间存活率无明显差异(p>0.05);冻存时间为3个月时,存活率开始下降,与对照组之间存活率存在明显差异(p<0.05);冻存时间增加至6个月后,存活率有明显降低,随着冻存的时间的增加,存活率逐渐下降;直至冻存时间为24个月的标本,存活率为3.30%±1.54%(p<0.05)。流式细胞仪分析细胞凋亡率,结果显示,冻存时间为1、2个月的脂肪组织颗粒与对照组比较,细胞凋亡比例无明显差异(p>0.05);冻存时间增加为3个月时细胞凋亡比例存在明显的下降,并随着冻存时间的延长,细胞凋亡比例逐渐增加,至冻存24个月后,细胞凋亡比例为94.2%±4.55%(p<0.05)。油红o染色结果显示,新鲜脂肪组织颗粒镜下存在绝大部分被染红的脂滴和蓝染胞核;冻存时间为1、2个月时镜下冻存脂肪组织颗粒被染红的脂滴和蓝染胞核数量并未出现明显变化;冻存时间为3个月时被染红的脂滴和蓝染胞核数量下降,红色脂滴互相融合成大脂滴;随着冻存时间的增加,被染红的脂滴和蓝染胞核数量下降明显,大部分为被染红的融合大脂滴;至冻存时间为24个月时,镜下红色脂滴较少见。葡萄糖转移量实验分析细胞活性结果显示,以新鲜脂肪组织颗粒细胞活性为100%,通过葡萄糖转移量计算出不同时间冻存脂肪组织颗粒的细胞活性。结果显示,冻存时间为1、2个月时细胞活性分别为94.7%±4.40%和92.5%±5.10%,细胞活性与对照组无明显差异(P>0.05)。冻存时间增加为3个月时,细胞活性为75.3%±4.80%,细胞活性显著下降且与对照组存在统计学差异(P<0.05)。冻存时间逐渐增加时,细胞活性逐渐下降,至冻存时间为24个月时细胞活性为4.9%±3.20%。结论:离心纯化人脂肪组织颗粒在-20℃下冻存2个月内,脂肪细胞存活率与新鲜脂肪组织颗粒无明显差异。