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快速碱化因子(Rapid Alkalinization Factor, RALF)作为受体介导的信号载体在植物防御和发育的调节中起关键作用，是一类在植物界保守地、能抑制氢泵活性从而调控细胞伸长的重要多肽激素。植物在分类成单子叶植物和双子叶植物之前就存在RALF蛋白家族，可能行使不同功能。拟南芥数据库中可检索到39种RALF基因，除了部分RALF功能和机制研究较为清楚之外，大部分的结构、和生物学功能并不清楚。为了比较不同RALF的生物学功能差异，本课题首先拟通过生物信息学的方法对拟南芥不同RALF的理化性质、蛋白结构进行初步分析。然后构建RALF基因的过表达载体，建立拟南芥缺失突变体和过表达转基因植株材料，观察拟南芥突变体的表型，研究拟南芥不同RALF基因的功能。通过本论文的研究，我们得到主要实验结果如下：
(1)对拟南芥RALF家族的理化性质进行了预测的归纳分析。结果显示大多数拟南芥RALF蛋白的分子量、亲水性、正/负电荷残基数、pI值、不稳定系数、脂肪系数等理化性质较为相似，但RALF23和RALF34具有较大的相对分子质量。除了AT2G32788蛋白为疏水性蛋白，其余的38种RALF蛋白皆为亲水性蛋白，有27个蛋白质属于不稳定蛋白质，AT2G32788、RALF14、RALF25具有较大的脂肪指数，表明RALF家族在具有诱导植物组织间碱化的功能同时，某些蛋白还具有独特的生理生化功能。
(2)对拟南芥RALF家族的序列相似性和亲缘关系进行了分析。结果显示利用系统发育树将拟南芥RALF家族的39个成员分成6类，基因点阵图检验结果显示该分类与功能密切相关，保守基序分析分析显示motif1和motif2在6类RALF中均保守，Logo分析表明半胱氨酸在维系RALF生物功能中可能发挥着重要的作用，SignalP4.1分析显示90%的RALF蛋白均存在信号肽。
(3)拟南芥RALF基因T-DNA插入突变体的鉴定和部分RALF过表达植株的构建和鉴定。对从ABRC网站上购买拟南芥328株插入突变体进行3引物法鉴定，获得ralf1、ralf3、ralf4、ralf6、ralf7、ralf12、ralf17、ralf20、ralf21、ralf23、ralf27、ralf30和ralf33等13种纯合突变体，定量PCR结果显示纯合体种13种RALF表达量分别显著降低。构建并获得了RALF1-OE、RALF6-OE、RALF7-OE、RALF17-OE、RALF20-OE、RALF23-OE、RALF31-OE、RALF33-OE等8种过表达植株(每种植株都有2种以上的株系)，定量PCR结果显示相应RALF的表达量均显著增加。
(4)拟南芥部分ralf缺失突变体表型的初步分析。对鉴定到的13种纯合突变体的表型进行了初步分析，结果显示ralf1、ralf23和ralf33缺失突变体中根毛减少，根长变长并提前抽苔；拟南芥ralf17缺失突变体的莲座叶叶片小，植株矮小，生长缓慢；除ralf17外，其他12种突变体种WRKY53、PDF1.2和FRK1等抗逆标记基的因表达量均有不同程度地上调。根部接种内生真菌后，拟南芥ralf1和ralf33缺失突变体的真菌量都有不同程度的减少。利用RALF1处理野生型拟南芥会导致RALF1、RALF31的基因表达显著下调。
综上所述，39种拟南芥RALF基因家族虽然大都具有相类似的理化特性和相近的亲缘关系，但是不同RALF基因发挥不同功能，某些RALF基因调控植物细胞发育和生长，某些RALF基因调控植物免疫与抗逆，RALF基因不同程度地影响植物表型和植株抗胁迫的能力。并且，不同RALF基因表达之间也存在联系。
(1)对拟南芥RALF家族的理化性质进行了预测的归纳分析。结果显示大多数拟南芥RALF蛋白的分子量、亲水性、正/负电荷残基数、pI值、不稳定系数、脂肪系数等理化性质较为相似，但RALF23和RALF34具有较大的相对分子质量。除了AT2G32788蛋白为疏水性蛋白，其余的38种RALF蛋白皆为亲水性蛋白，有27个蛋白质属于不稳定蛋白质，AT2G32788、RALF14、RALF25具有较大的脂肪指数，表明RALF家族在具有诱导植物组织间碱化的功能同时，某些蛋白还具有独特的生理生化功能。
(2)对拟南芥RALF家族的序列相似性和亲缘关系进行了分析。结果显示利用系统发育树将拟南芥RALF家族的39个成员分成6类，基因点阵图检验结果显示该分类与功能密切相关，保守基序分析分析显示motif1和motif2在6类RALF中均保守，Logo分析表明半胱氨酸在维系RALF生物功能中可能发挥着重要的作用，SignalP4.1分析显示90%的RALF蛋白均存在信号肽。
(3)拟南芥RALF基因T-DNA插入突变体的鉴定和部分RALF过表达植株的构建和鉴定。对从ABRC网站上购买拟南芥328株插入突变体进行3引物法鉴定，获得ralf1、ralf3、ralf4、ralf6、ralf7、ralf12、ralf17、ralf20、ralf21、ralf23、ralf27、ralf30和ralf33等13种纯合突变体，定量PCR结果显示纯合体种13种RALF表达量分别显著降低。构建并获得了RALF1-OE、RALF6-OE、RALF7-OE、RALF17-OE、RALF20-OE、RALF23-OE、RALF31-OE、RALF33-OE等8种过表达植株(每种植株都有2种以上的株系)，定量PCR结果显示相应RALF的表达量均显著增加。
(4)拟南芥部分ralf缺失突变体表型的初步分析。对鉴定到的13种纯合突变体的表型进行了初步分析，结果显示ralf1、ralf23和ralf33缺失突变体中根毛减少，根长变长并提前抽苔；拟南芥ralf17缺失突变体的莲座叶叶片小，植株矮小，生长缓慢；除ralf17外，其他12种突变体种WRKY53、PDF1.2和FRK1等抗逆标记基的因表达量均有不同程度地上调。根部接种内生真菌后，拟南芥ralf1和ralf33缺失突变体的真菌量都有不同程度的减少。利用RALF1处理野生型拟南芥会导致RALF1、RALF31的基因表达显著下调。
综上所述，39种拟南芥RALF基因家族虽然大都具有相类似的理化特性和相近的亲缘关系，但是不同RALF基因发挥不同功能，某些RALF基因调控植物细胞发育和生长，某些RALF基因调控植物免疫与抗逆，RALF基因不同程度地影响植物表型和植株抗胁迫的能力。并且，不同RALF基因表达之间也存在联系。