目的:人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)感染人体后会导致CD4~+T淋巴细胞数目显著下降,最终引发获得性免疫缺陷综合征(acquired immunodeficiency syndrome,AIDS)。抗逆转录病毒治疗(anti-retroviral therapy,ART)虽然可以快速降低患者体内的病毒载量(Viral load,VL),但是一旦停止ART,患者体内的VL会快速反弹,功能性治愈HIV的目标始终无法实现。众多文献表明HIV不能被彻底根除的原因主要是病毒储存库的存在。人体中的多种组织和细胞都参与储存库的建立和维持,包括外周血、淋巴结、中枢神经系统和肠粘膜相关组织中的初始T细胞(na?ve T cell,TNA)、中心记忆T细胞(central memory T cell,TCM)、效应记忆T细胞(effector memory T cell,TEM)、干细胞样记忆T细胞(T stem cell memory,TSCM)、移行记忆T细胞(transitional memory T cell,TTM)等。静息记忆CD4~+T细胞具有长期存活并能使HIV在体内转录沉默的特征,所以使其成为最重要的HIV储存库。CD38和HLA-DR一直被视为HIV的活化标志。目前HIV感染者的静息记忆T细胞主要是用CD45RA~-/RO~+及HLA-DR~-来定义。我们前期分析活化亚群功能时发现HIV感染者的CD4~+TCM上CD38表达显著高于HLA-DR。进一步研究发现,NA?VE、TCM、TEM细胞CD38和HLA-DR亚群的表达有很大差异,未活化的NA?VE细胞表面HLA-DR不表达,但CD38却高表达,储存库重要细胞CD4~+TCM上CD38~+HLA-DR~-表达的比例较高。以往研究也显示,TCM上CD38表达较高。CD38被称作环状ADP核糖水解酶或T10,是一种单链跨膜糖蛋白。在HIV中CD8CD38~+的表达被作为细胞活化的标志。但后续研究发现CD38在CD4~+T细胞和CD8~+T细胞表达的意义是不同的,CD8~+CD38~+亚群是活化细胞,而CD4~+CD38~+亚群代表未成熟细胞。研究显示CD38~+细胞表达病毒储存库标志并且CD38~+还可以促进肿瘤细胞的增殖并抑制其凋亡。而长期存活和稳态增殖正是储存库细胞的重要特点。2014年有学者报道HIV感染者在接受ART治疗1年后,储存库的含量HIV total DNA、2-LTR和HIV integrate DNA在CD38~+与CD38~-上的表达无差异,而且发现在治疗12周后,CD38~+细胞相对于HLA-DR~-CD38~-的病毒半衰期更长。TCM细胞CD38表达的特征如何,是否可作为长期治疗的病毒储存库尚无报道。抗病毒治疗1-2年主要清除活化CD4~+T细胞中的病毒,对于储存库细胞的抑制作用较弱。研究显示随访治疗7年,潜伏感染细胞的储存库含量有一定程度的动态变化,并且发现治疗大于3年的患者其病毒半衰期更短,长期治疗对于清除储存库十分关键。但CD38对HIV感染长期治疗者储存库的贡献尚无研究。本课题拟深入研究CD4~+CD38~+TCM细胞的具体特征及其对病毒储存库的作用,为病毒储存库形成机制及治愈HIV提供新思路。研究方法:研究对象。30例接受ART的HIV感染者:ART>5年,CD4~+T cells>350,VL<50copies/ml。实验方法包括:1、T淋巴细胞绝对值计数。将20μL CD4/CD8/CD3 TriTEST试剂分别加入绝对计数管中,用逆向加样法加入50μL抗凝血,室温避光15分钟,加入免洗溶血素450μL,室温,避光15分钟。用FACSCalibur流式细胞仪上样并用MultiSET软件检测进行自动分析,计算CD4~+、CD8~+T、CD3~+T细胞绝对值及相应比值。2、HIV病毒载量测定。采用Roche公司The COBAS?Ampli Prep?/COBAS?TaqMan?HIV-1 Test,v2.0试剂盒在COBAS?TaqMan?系统进行全自动PCR反应体系制备及病毒载量检测。检测下限为1copy/mL。3、密度梯度离心提取外周血单个核细胞。抽取HIV-1感染者的外周血,将新鲜外周血与磷酸盐缓冲液(Phosphate buffer saline,PBS)按照1:1的比例充分混匀,将混合液缓慢匀速地加入到与全血等量的淋巴细胞分离液液面上,并进行密度梯度离心。密度梯度离心后,小心吸取白膜层。用PBS洗两遍,弃去上清,即为PBMCs。4、CD4~+T细胞负选。细胞提取HIV感染者的新鲜外周血PBMCs,用Stem Cell公司的CD4~+T细胞富集试剂盒阴性选择所需的CD4~+T细胞5、细胞分选。使用流式分选仪FACS Aria进行CD4~+TCMCD38~+和CD4~+TCMCD38~-细胞分选。6、流式检测CD4~+CD38~+TCM的特征。将提取的外周血单个核细胞,进行表面染色:CD3-PE-CY7、CD4-APC-CY7、CD38-PE、HLA-DR-APC、CD45RA-FITC、CCR7-Percp–CY5、CD25-PE-CY7、CD69-APC、PD-1-FITC、CD127-APC、Ki-67-Violet,4℃避光30分钟,4度2%FBS洗液,300g,10min,升5降5,4度离心,弃上清,250ulPBS重悬细胞,BD LSRⅡ流式细胞仪及BD FACSDiva TM软件检测并分析CD4~+CD38~+TCM的活化水平等细胞特征。7、DNA提取。将分选的CD4~+T细胞和CD4~+TCM CD38~+和CD4~+TCM CD38~-,用QIAamp blood DNA mini kit按照操作说明提取DNA,溶于50μl无酶水中。8、数字液滴PCR检测HIV total DNA。将提取的DNA样本,采用数字液滴PCR的体系配置及具体反映程序进行检测。RPP30作为HIV total DNA定量的内参。9、敲除CD38的CD4~+T淋巴细胞功能的检测。96孔U底板分别标记好未处理组、对照组及实验组,每孔细胞分别用100ul无血清1640培养基重悬,SIRNA-CD38及SIRNA-NC分别以20nM为转染终浓度,具体转染过程:将100ul的无血清1640培养基溶解si-Control及si-CD38,轻轻震荡,然后加入1μl/0.2million细胞的转染试剂Lipofectamine?RNAiMAX,震荡室温后共孵育20分钟。然后将si-CD38及si-Control加入细胞孔中。放置于培养箱中48小时后检测敲除效率。在96小时检测si-CD38及阴性对照的凋亡(Annexin-V及7-AAD)。5天后检测si-CD38及阴性对照的增殖。增殖的具体过程;将过夜的si-Control及si-CD38两种不同处理的细胞标记Violet Cell Trace(5μM),并且在CD3/CD28beads(1μg/ml)刺激。共培养4天。然后用BD LSR II检测CD4~+T细胞的增殖情况。10、统计学分析。用SPSS17.0统计软件及Graphpad Prism5.0软件进行统计学分析,相关的两组之间的比较用两样本的配对T检验,P<0.05为有统计学意义。结果:1、HIV感染者长期治疗后CD4~+记忆T细胞CD38、HLA-DR表达不同。CD38在TCM和NAIVE细胞上均高表达,并且NA?VE、TCM和TEM上CD38的表达都高于HLA-DR(P<0.001、P<0.001、P=0.009)。NA?VE、TCM、TEM上CD38和HLA-DR亚群的表达有很大差异,CD4~+TCM上CD38~+DR~-表达的比例较高。CD4~+CD38~+与CD4~+HLA-DR~-有相似的TCM表达。2、CD4~+CD38~+TCM具有储存库细胞的特征。CD4~+CD38~+TCM低表达活化分子CD25、CD69,与经典储存库细胞CD4~+HLA-DR~-TCM非常相似,但与活化细胞CD4~+HLA-DR~+有差异(P=0.028、P=0.015)。CD4~+CD38~+TCM储存库标志分子PD-1、KI-67在CD4~+CD38~+TCM的表达高于经典储存库CD4~+HLA-DR~-TCM(P=0.009、P=0.040),但和CD4~+HLA-DR~+无显著差别。CD4~+CD38~+TCM的CD127的表达高于CD4~+HLA-DR~+(P=0.010),但比CD4~+HLA-DR~-TCM低(P=0.003)。3、CD4~+CD38~+TCM与CD4细胞的HIV total DNA具有相关性。CD4~+CD38~+TCM与CD4细胞的HIV total DNA具有正相关(r=0.505,P=0.033),CD4~+CD38~-TCM与CD4细胞的HIV total DNA无相关性。我们又采用负二项回归模型来评价HIV total DNA和CD4~+CD38~+TCM和CD4~+CD38~-TCM的关系,发现CD4~+CD38~+TCM能够预测CD4细胞的HIV total DNA的含量(P=0.018),在用当前CD4~+T细胞和基线CD4~+T细胞校正后依然能够预测(P=0.009,P=014)。4、CD38~+对于储存库TCM的贡献更大。我们用流式细胞仪检测TCM上CD38~+和CD38~-的表达,发现CD38~+的表达均高于CD38~-(P<0.001),然后用数字液滴PCR检测这两群细胞的HIV total DNA,发现CD4~+TCMCD38~+的HIV total DNA含量高于CD4~+TCMCD38~-(P=0.0358)。5、CD38能够促进HIV感染者CD4~+T细胞的增殖和存活并抑制其凋亡。我们首先将HIV感染者CD4~+T细胞的CD38敲除,发现si-CD38组的增殖要显著低于si-Control组(P=0.011)、si-CD38组的7-AAD显著高于si-Control组(P=0.003)、si-CD38组的Annexin-V显著高于si-Control组(P=0.004)。结论:1、CD4~+CD38~+TCM具有储存库特征,对HIV储存库有重要贡献。2、CD38可通过降低CD4~+T细胞的凋亡能力、增高其增殖和存活能力来发挥对HIV储存库重要细胞TCM的作用。