背景及目的新生儿肺出血(neonatalpulmonaryhemorrhage，NPH)是新生儿期危重急症之一，围产期缺氧/窒息是NPH的主要病因之一，其主要病理生理改变为肺动脉高压和肺血管内皮细胞损伤。缺氧诱导因子-1(hypoxiainduciblefactor-1，HIF-1)是机体细胞适应低氧的主要中介物质，通过它进而对其下游的一系列缺氧反应基因进行转录调节，从而产生一系列病理生理反应。内皮素-1(endothelin-1，ET-1)是血管内皮细胞分泌的一种重要的缩血管因子，ET-1基因是缺氧反应基因之一。我们的前期研究工作初步证实HIF-1α可通过调节ET-1而参与内皮细胞损伤及肺出血的形成。 RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是指双链RNA(double-strandedRNA，dsRNA)介导的序列特异性转录后同源靶基因沉默现象，RNAi技术是一种简单有效的替代基因敲除、研究基因功能的有力工具。为应用这一技术研究HIF-1在缺氧过程中的作用，我们采用HIF-1αsiRNA重组腺病毒(AdsiHIF-1α)为主要实验工具，该AdsiHIF-1α是来源于我们的另一项实验研究。该研究中，我们根据基因库提供的资料，选择人HIF-1α基因的不同位点，设计合成了6对相应的siRNA寡核苷酸序列，制备了siRNA重组穿梭载体，并将其和复制缺陷型腺病毒载体同源重组，得到带有外源DNA的重组腺病毒载体，转染HEK293细胞后得到能转录出HIF-1α基因siRNA的复制缺陷型腺病毒。利用此腺病毒感染细胞或动物，可将HIF-1α基因siRNA转入靶细胞或靶组织，实现HIF-1α基因的RNAi。腺病毒是转基因技术的常用载体，它可稳定地将目的基因导入受体细胞并表达，而且效率高，宿主细胞范围广泛，易于制取、纯化、浓缩，是实现准确、高效RNA干扰的理想工具。 本实验的目的，是利用在大鼠肺微血管内皮细胞(ratpulmonarymicrovascularendothelialcells，RPMVECs)培养液中加入CoCl2以模拟细胞缺氧环境(此方法操作简便，条件易控制，试验结果与缺氧基本一致)，和AdsiHIF-1α感染RPMVECs的方法，通过对HIF-1α和ET-1基因表达的干扰，研究HIF-1α和ET-1基因在大鼠RPMVECs缺氧过程中的作用。为下一步将“在RPMVECs的研究”转为“在体内的研究”奠定基础，为研究新生儿肺出血发病机制提供更为深化的理论依据。 方法1、原代培养RPMVECs：取出生1天的SD乳鼠周边肺组织，剪成1mm×1mm×1mm的组织块，贴入无菌的6孔板，每孔5～10块，同时加入含20％胎牛血清、肝素90U/ml、VEGF50ng/ml、青霉素100U/ml和链霉素100μg/ml的“完全DMEM”培养基1ml，放入37℃5％CO2培养箱中静置培养。1h补充足量培养液继续培养。60h后取出肺组织块，更换“完全DMEM”培养基继续培养5d～7d后进行传代。 2、复苏冻存的人胚肾上皮细胞(HEK293细胞)并传代培养。利用在培养基中加入原代HIF-1αsiRNA重组腺病毒的方法，在HEK293细胞中大量扩增HIF-1αsiRNA重组腺病毒，测定滴度，备下一步实验。相同的方法扩增对照腺病毒(Ad/null，为未插入外源基因的空载体重组腺病毒，故不能转录出HIF-1αsiRNA)。 3、HIF-1αsiRNA重组腺病毒干扰大鼠肺微血管内皮细胞HIF-1α及ET-1基因的表达。实验分组： A组(正常对照)：常氧下(5％CO2、95％空气、37℃)培养。 B组(CoCl2刺激)：含100μMCoCl2培养基培养4h。 C组(重组腺病毒感染24h+CoCl2)：Ad/siHIF-1α感染24h后，加入CoCl2(终浓度100μM)继续培养4h。 D组(重组腺病毒感染48h+CoCl2)：Ad/siHIF-1α感染48h后，加入CoCl2(终浓度100μM)继续培养4h。 E组(重组腺病毒感染72h+CoCl2)：Ad/siHIF-1α感染72h后，加入CoCl2(终浓度100μM)继续培养4h。 F组(对照腺病毒感染72h+CoCl2)：Ad/null感染72h后，加入CoCl2(终浓度100μM)继续培养4h。 各组按以上方法处理后，采用荧光定量PCR法检测HIF-1α和ET-1基因水平，Westernblotting法检测HIF-1α蛋白表达水平，ELISA法检测ET-1蛋白表达水平，以观察HIF-1αsiRNA重组腺病毒对缺氧RPMVECs的HIF-1α及其下游基因ET-1的表达调控作用。 结果1、肺微血管内皮细胞通过倒置相差显微镜观察，细胞呈鹅卵石镶嵌状排列，状如梭形或多角形，大小均匀，胞核清晰，呈卵圆形，胞浆丰富。免疫组化染色显示，内皮细胞Ⅷ因子相关抗原阳性，经鉴定完全符合肺微血管内皮细胞特征。 2、在30代以内的293细胞中扩增出AdsiHIF-1α，经倍比终点稀释法测定，病毒滴度为2×109pfu/ml。 3、荧光定量PCR检测HIF-1α及ET-1基因mRNA水平，结果显示：(1)正常对照组A的HIF-1αmRNA相对含量为1.0±0.00。CoCl2刺激组B的HIF-1αmRNA相对含量为1.12±0.05，与A组比较上调不明显(P＞0.05)。AdsiHIF-1α感染24h、48h、72h的C、D及E组HIF-1αmRNA相对含量分别为0.45±0.02、0.31±0.01及0.27±0.01，相对于B组分别下调了60％、72％及76％(P＜0.05)。对照病毒感染组F的HIF-1αmRNA相对含量为1.17±0.08，相对于B组上调了4％(P＞0.05)。 (2)正常对照组A的ET-1mRNA相对含量为1.0±0.00。CoCl2刺激组B的ET-1mRNA相对含量为5.65±0.80，与A组比较明显上调(P＜0.05)。AdsiHIF-1α感染24h、48h、72h的C、D及组E的ET-1mRNA相对含量分别为2.34±0.28、1.46±0.26及1.16±0.41，相对于B组分别下调了59％、74％、79％(P＜0.05)。对照病毒感染组F的HIF-1αmRNA相对含量为5.60±0.87，相对于B组下调了1％(P＞0.05)。 4、Westernblot检测HIF-1α蛋白的表达，结果显示：正常对照组A的HIF-1α蛋白相对含量为0.258±0.020。CoCl2刺激组B的HIF-1α蛋白相对含量为0.948±0.015，与A组比较明显上调(P＜0.05)。AdsiHIF-1α感染24h、48h、72h的C、D及E组HIF-1α蛋白相对含量分别为0.438±0.019、0.345±0.010和0.331±0.014，相对于B组分别下调了54％、64％及65％(P＜0.05)。对照病毒感染组F的HIF-1α蛋白相对含量为0.929±0.028，相对于B组下调了2％(P＞0.05)。 5、ELISA检测ET-1蛋白水平，结果显示：正常对照组A的ET-1蛋白含量为13.22±0.69，CoCl2刺激组B的ET-1蛋白含量为94.39±1.00pg/ml，与A组比较明显上调(P＜0.05)。AdsiHIF-1α感染24h、48h、72h的C、D及组E的ET-1蛋白含量分别为51.42±2.18、44.80±1.51及42.77±1.09，相对于B组分别下调了46％、53％及55％(P＜0.05)。对照病毒感染组F的ET-1蛋白含量为93.17±2.20，相对于B组下调了1％(P＞0.05)。 结论1、成功培养了大鼠肺微血管内皮细胞，是一种较为理想的研究人体肺组织细胞病理生理改变的体外模型。 2、我们前期研究工作构建的HIF-1αsiRNA重组腺病毒(AdsiHIF-1α)能够有效沉默缺氧诱导的大鼠肺血管内皮细胞HIF-1α基因、继而影响其下游ET-1基因的表达。HIF-1α及ET-1基因与大鼠肺血管内皮细胞的缺氧过程密切相关，从而参与了缺氧诱导的肺血管内皮细胞损伤及最终导致新生儿肺出血的发生、发展过程。我们构建的AdsiHIF-1α可作为基因沉默的工具，为下一步在动物体内研究HIF-1α及其下游基因ET-1在新生儿肺出血发病机制中发挥作用。