水稻（Oryza sativa L.）是我国最主要的粮食作物,在保障国家粮食安全中发挥重要作用。氮素是影响水稻产量最主要的矿质元素。目前中国稻田氮肥吸收利用率仅为40%左右,与主要产稻国相比,中国水稻生产氮肥施用量较高而利用率较低。硝酸还原酶（Nitrate reductase,NR）是植物体内同化硝态氮的关键酶,是诱导酶,其活性受翻译后磷酸化修饰调控,由光向暗NR活性迅速降低,减少了植株对硝态氮的吸收与同化。因此,研究水稻硝酸还原酶活性的磷酸化调控机制对提高水稻硝态氮同化能力和氮素利用效率具有重要的实践意义。本研究根据水稻硝酸还原酶NIA1磷酸化位点及邻近氨基酸残基的生化特性,通过氨基酸残基的定向突变模仿永久磷酸化、非永久磷酸化、永久氧化和非永久氧化,构建NIA1磷酸化位点及邻近氨基酸残基定向突变转化载体,以粳稻品种Kitaake为受体材料进行遗传转化,研究磷酸化位点及邻近氨基酸残基定向突变对NIA1磷酸化水平和NR活性影响,为水稻高效利用氮素提供理论依据。主要研究成果如下:（1）从粳稻品种Kitaake中克隆获得OsNia1基因,通过磷酸化位点预测和同源比对分析,推测调控NR活性的磷酸化位点为NIA1氨基酸序列第532位的丝氨酸残基S₅₃₂;对NR的表达特性进行分析,发现OsNia1基因表达、NR活性、NIA1蛋白及其磷酸化水平均具有光周期特性,低温胁迫抑制OsNia1基因的表达,硝态氮则诱导OsNia1基因的表达。构建了NIA1磷酸化位点及邻近氨基酸残基T₅₃₁、M₅₃₆和S₆₂₇定向突变的过表达转基因株系,通过对转基因株系的表型和氮素利用进行分析,发现NIA1磷酸化位点及邻近氨基酸残基定向突变株系和OsNia1过表达株系的生长发育均劣于野生型,NIA1磷酸化位点及邻近氨基酸T₅₃₁和S₆₂₇的定向突变提高了转基因株系叶片的NR活性,加快了硝态氮的同化;邻近氨基酸残基M₅₃₆的定向突变降低了转基因株系叶片的NR活性,硝态氮的同化能力降低。（2）NIA1磷酸化位点的定向突变打破了NR活性的昼夜节律,光照和黑暗条件下转基因株系的NR活性均明显提高,NR活性状态稳定在80%左右;邻近氨基酸残基T₅₃₁和S₆₂₇定向突变株系的NR总活性、实际活性及活性状态均略有提升,但NR活性的昼夜节律未受影响;邻近氨基酸残基M₅₃₆定向突变株系的NR活性均低于野生型,夜间NR活性状态高于野生型。研究表明通过定向突变磷酸化位点降低NIA1蛋白的磷酸化水平是提高NR活性和硝酸盐同化效率的有效途径。（3）与野生型、空载体和OsNia1过表达株系相比,常温条件下NIA1磷酸化位点定向突变株系的株高、根长、干物质重、叶绿素和可溶性糖含量均较低,NR活性、铵态氮、游离氨基酸、亚硝酸盐、H₂O₂和MDA含量均较高;低温胁迫下NIA1磷酸化位点定向突变转基因株系叶片中硝酸根同化途径相对活跃,亚硝酸盐积累量及H₂O₂和MDA含量降低,株高、根长、干重、叶绿素含量、可溶性糖含量、铵态氮及游离氨基酸含量均高于野生型、空载体和OsNia1过表达株系;低温胁迫下供试材料中铵态氮含量均有所上升。表明常温条件下亚硝酸盐的积累抑制NIA1磷酸化位点定向突变株系水稻幼苗的生长,NR活性的提高增强了水稻对低温胁迫的耐受性。（4）铵硝混合营养条件下NIA1磷酸化位点定向突变株系的株高、地上部干重、叶绿素含量均低于野生型、空载体和OsNia1过表达株系,NR活性、NH₄⁺-N、游离氨基酸、亚硝酸盐、H₂O₂和MDA含量则较高;以硝态氮作为氮源,NIA1磷酸化位点定向突变转基因株系的株高、地上部干重、叶绿素含量、NR活性、NH₄⁺-N、游离氨基酸和亚硝酸盐含量均高于野生型、空载体和OsNia1过表达株系,供试材料叶片中的H₂O₂和MDA含量无显著差异;以铵态氮作为氮源,除NR活性外,供试材料叶片中的各项生理指标均无显著差异;以铵硝混合营养作为氮源,供试材料中的NH₄⁺-N的含量与以铵态氮作为氮源时持平,以硝态氮作为氮源NH₄⁺-N的含量最低;与铵硝混合营养相比,硝态氮培养下NIA1磷酸化位点定向突变转基因株系叶片中亚硝酸盐的含量与其他供试材料之间差异较小。说明单是水稻叶片中NR活性的改变和铵态氮含量的升高并不会对水稻的表型和生理产生影响,铵硝混合营养作为氮源时硝态氮同化速率提高导致亚硝酸盐的过量积累是NIA1磷酸化位点定向突变株系长势较弱的原因,同时以硝态氮作为氮源时磷酸化位点的定向突变提高了水稻的NR活性,促进了对NO₃^--N的转化效率,增强水稻幼苗对铵态氮亏缺的耐受性。综上,正常生长条件下NIA1磷酸化位点的定向突变能够提高水稻的NR活性,增强硝态氮的同化速率,同时亚硝态氮的积累对水稻的生长发育会造成不良影响;低温胁迫和铵态氮亏缺下磷酸化位点的定向突变能够提高水稻的氮素营养,降低亚硝酸盐的积累,增强水稻对低温和氮饥饿的耐受能力。