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目的:通过脑微血管内皮细胞(Brain microvascular endothelial cells BMEC)细胞培养为实验模型,从体外直接观察水蛭地龙提取液能否激活内源性纤溶系统,即能否促进培养的 BMEC 分泌组织型纤溶酶原激活物(tissue-type plasminogen activator t-PA),同时增加其活性,及对纤溶酶原激活剂抑制物-1(plasminogen activator inhibitor PAI-1)分泌及其活性的影响。从而揭示该制剂对缺血性脑血管疾病的作用机制。 方法:采用体外培养鼠大脑皮质脑微血管内皮细胞为实验模型,并用水蛭地龙提取液干预。培养鼠脑微血管内皮细胞,分实验组和对照组,各组均为 9 孔细胞,按 3×104个细胞/孔接种,培养至第 9 天细胞长满孔底。实验组中加入不同浓度的水蛭地龙提取液 10mg/ml、20mg/ml、80mg/ml 稀释浓度;另以 20mg/ml 浓度水蛭地龙提取液分别处理 BMEC 8h、24h、48h。实验选取多项指标观察水蛭地龙提取液,对各个实验组 BMEC 分泌 t-PA 和 PAI-1 的影响:倒置显微镜下观察细胞形态和生长情况、测定 t-PA 和 PAI-1 的活性和含量、以 RT-PCR 检测两者的 mRNA 的表达情况。 结果:⑴ 水蛭地龙提取液可促进 BMEC 生长,药物处理组接种时贴壁早,且分裂增殖快,聚集成簇,细胞胞体更大,细胞大多呈多边形。⑵ 不同浓度水蛭地龙提取液组，与正常对照组间比较，均能使 BMEC分泌的 t-PA 活性明显增加(P<0.01)，随着处理药物浓度增加，t-PA活性也相应增加，但各药物处理组对 PAI-1 活性无明显影响(P>0.05)。⑶ 水蛭地龙提取液（20mg/ml）处理 BMEC 8h、24h、48h，各相应时间点药物处理组与对照组比较，均能增加 BMEC 分泌的 t-PA 活性(P<0.01)。且随着处理时间的延长，t-PA 活性增加愈明显，当药物处理达 48h t-PA 活性达高峰，而对 PAI-1 活性无明显影响(P>0.05)。⑷通过对 BMEC 培养上清液中 t-PA 抗原含量定量分析，表明水蛭地龙提取液可明显增加 BMEC 分泌 t-PA 含量(P<0.05)。⑸ 用 RT-PCR 技术对t-PA 和 PAI-1 mRNA 表达进行检测，发现水蛭地龙提取液对培养 BMEC，在转录水平使 t-PA 的 mRNA 表达增强，但对 PAI-1 mRNA 的表达没有显著影响。⑹ 免疫细胞化学证实随水蛭地龙提取液浓度的增加，t-PA表达表达增强。 结论：通过以上实验，可以得出以下结论：①水蛭地龙提取液促进 BMEC 生长，药物处理组接种时贴壁早，且分裂增殖快，聚集成簇，细胞胞体更大，细胞大多呈多边形。②水蛭地龙提取液增加 BMEC 分泌的 t-PA 活性，但对 PAI-1 活性无明显影响。③ 通过对 BMEC 培养上清液中 t-PA 抗原含量测定，表明水蛭地龙提取液可明显增加 BMEC 分泌t-PA 含量。④ 用 RT-PCR 技术对 t-PA 和 PAI-1 mRNA 表达进行检测，发现水蛭地龙提取液对培养 BMEC，在转录水平使 t-PA 的 mRNA 表达增强，但对 PAI-1 mRNA 转录没有影响。总之，体外实验研究发现水蛭地龙提取液可促进 BMEC 分泌 t-PA、增加其活性、增强 mRNA 转录，表明水蛭地龙提取液可促进纤溶系统功能活跃，而不影响抗纤溶系统稳定状态。重庆医科大学研究生学位论文 5第 二 部 分水蛭地龙提取液对缺氧引起大脑皮质神经细胞毒性损害保护作用的实验研究摘 要目的:本实验从细胞水平,观察水蛭地龙提取液抑制缺氧诱导大脑皮质神经细胞坏死和调亡的作用,为临床治疗缺血性脑血管疾病提供更多的实验依据。方法:本实验制备体外培养鼠大脑皮质神经细胞缺氧模型,选择多项观察指标包括倒置显微镜下观察正常和缺氧神经细胞生长情况、反映细胞损害经典指标乳酸脱氢酶(LDH)释放率的测定及用 Annexin Ⅴ-PI 双染色法流式细胞仪进行坏死、凋亡细胞计数等。结果: ⑴ 初种神经细胞 2h 开始贴壁,48h 后可见大部分细胞贴壁,细胞形态比较单一呈圆球形,偶见细胞长出突起。第 5 天神经元中混杂较多胶质细胞,换 N2 培养液抑制杂细胞生长,至第 11 天,神经细胞则生长旺盛,胞体变大,长出 2-3 个突起,突起变长,与邻近的神经元的胞体或突起形成突触,大部分胶质细胞死亡浮起,神经细胞纯化达 95%以上。⑵ 缺氧模型的建立:用于实验的神经细胞置于 95%N2 和 5% CO2混合气体培养盒中继续培养,血气分析表明,常氧、缺氧12h 和缺氧 24h 培养上清液中的氧分压分别为的 16.7kPa(125mmHg)、2.8 kPa(21mmHg)和 2.4 kPa(18mmHg),结合细胞生长情况,缺氧 12h适合用作缺氧模型。⑶ 缺氧处理后细胞乳酸脱氢酶释放率测定显示,缺氧组乳酸脱氢酶释放率明显高于正常对照组(P <0.01)。水蛭地龙