海鱼胃肠中富脂及产红色色素海洋细菌的分离、筛选及初步分析

来源 :广东医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:moshi122
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【目的】  1. 分离、培养、鉴定和储藏深海鱼胃肠道中的海洋细菌,作为微生物物种资源收藏;  2. 通过对多种脂类分析方法的分析比较,建立一种能快速简便、高效地分析筛选富脂,尤其是富含多不饱和脂肪酸的海洋细菌菌株方法;  3. 从分离培养的海洋细菌中筛选出具有生产单细胞油潜力的富脂菌株;进一步从富脂菌株筛选出具有生产多不饱和脂肪酸潜力的富脂菌株;  4. 对产脂肪酸尤其是多不饱和脂肪酸菌株的培养条件的优化,找到最优培养条件。  5. 对产红色色素细菌水溶性色素和脂溶性色素的分离制备及理化性质的分析,为类胡萝卜素的开发与研究奠定基础。  【方法】  1. 从中国南海中捕捞的海鱼,以其胃肠道洗脱液为样品,分离、纯化和培养其中的海洋细菌。  2. 采用16S rDNA片段PCR扩增、测序,Blast序列比对分析(Genbank网站),以 Phylip 软件构建系统发育树等分子生物学方法,对分离出的海洋细菌进行分类鉴定和生物多样性分析。  3. 采用尼罗红平板法,TTC平板法,H2O2平板法3种脂肪酸筛选方法的比较,建立一种快速高效的富脂菌株筛选方法。  4. 优化富含脂肪酸菌株的培养条件,找到一种最优的培养条件,并对其脂肪酸进行抽提并使之甲酯化后,采用气相色谱(GC)技术对产油菌株的脂肪酸组成进行定性和定量分析。  5. 选取红色海泥副球菌(Paracoccus lutimais)D15-24作为实验对象,发酵3L色素液、分离制备上清液及菌体中水溶性和脂溶性色素,并对其理化性质作出分析。  【结果】  1. 从中国南海中捕捞的马头鱼和白鲳,以其胃肠道洗脱液为样品,分离、纯化和培养出100株海洋细菌。  2. 采用16S rDNA片段PCR测序和序列分析等分子生物学方法,成功鉴定了94株分离培养的海洋细菌,它们分布于细菌域的3个门、3个纲、5个目、10个科、11个属、32个种,优势菌群为嗜冷杆菌属(Psychrobacter)。其中有5株红色细菌均为副球菌属( Paracoccus ),其中 Paracoccus lutimais 种 3 株、Paracoccus yeeii种和Paracoccus aminophilus种各1株。  3. 采用尼罗红平板法将分离得到的 89 株海洋细菌进行脂肪酸的初步筛选,从中筛选出15株细菌,再将采用TTC平板法,H2O2平板法对这15株细菌进行复筛,对比3种平板筛选,结果显示,尼罗红平板法的检出率最高,所以是用于初筛富脂海洋细菌的较好方法。  4. 将89株海洋细菌分别置于8℃、15℃、28℃尼罗红平板对比培养,在紫外灯下观察荧光颜色的深浅,粗略判断产脂菌株的最适培养温度为 15℃,对上述15株细菌作GC分析其脂肪酸的组分,脂肪酸含量在0.1%~2.6%之间。  5. 选取红色海泥副球菌(Paracoccus lutimais)D15-24作为实验对象,发酵3L发酵液,分离制备得到离心上清液水相红色色素、离心上清液有机相红色色素、菌体水相红色色素、菌体有机相红色色素,其收率分别为21.12 g/L、0.17 g/L、0.96 g/L、0.4 g/L。根据红色海泥副球菌(Paracoccus lutimais)D15-24的发酵液颜色、各色素层紫外全波长(200-800 nm)扫描结果及文献查阅的结果,可推测红色海泥副球菌(Paracoccus lutimais)D15-24所产生释放的色素极有可能是类胡萝卜素。  【结论】  本研究分离、纯化、并收藏了深海鱼胃肠道中海洋细菌 100 株,采用 16S rDNA片段PCR测序和序列分析等分子生物学方法,成功鉴定了其中的94株海洋细菌,它们分布于细菌域的 3 个门、3 个纲、5 个目、10 个科、11 个属、32个种,优势菌群为嗜冷杆菌属(Psychrobacter),有 5 株产红色色素的副球菌属(Paracoccus)细菌。采用尼罗红平板法、TTC 平板法,H2O2平板法对菌株进行脂肪酸的筛选比较,从中确定了尼罗红平板法为较好脂肪酸初筛方法;优化产脂肪酸菌株的培养条件,确定15℃为最佳培养温度,并将筛选出了15株富脂菌株作GC分析,15株细菌的脂肪酸含量在0.1%~2.6%之间。选取红色海泥副球菌(Paracoccus lutimais)D15-24作为实验对象,发酵3L发酵液,分离制备得到离心上清液水相红色色素、离心上清液有机相红色色素、菌体水相红色色素、菌体有机相红色色素,其收率分别为21.12 g/L、0.17 g/L、0.96 g/L、0.4 g/L。根据红色海泥副球菌(Paracoccus lutimais)D15-24 的发酵液颜色、各色素层紫外全波长(200-800nm)扫描结果及文献查阅的结果,推测红色海泥副球菌(Paracoccus lutimais)D15-24所产生释放的橙黄到紫红色色素极有可能是类胡萝卜素。本研究为湛江南海海洋微生物脂肪酸和色素资源的开发利用奠定了良好的基础。
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