【摘 要】
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目的:本文采用UPLC-FL（荧光）,开发人体唾液中N-acetyl-D-leucine（N-Ac-D-Leu）和N-acetyl-L-leucine（N-Ac-L-Leu）的光学异构体检测新方法。并将其方法应用于健康人和糖尿病患者唾液中N-Ac-D-Leu和N-Ac-L-Leu光学异构体的含量测定,分析健康人和糖尿病患者唾液中Ac-D,L-Leu定量值与D/L的变化,考察糖尿病诊断中的有效性。方
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目的:本文采用UPLC-FL（荧光）,开发人体唾液中N-acetyl-D-leucine（N-Ac-D-Leu）和N-acetyl-L-leucine（N-Ac-L-Leu）的光学异构体检测新方法。并将其方法应用于健康人和糖尿病患者唾液中N-Ac-D-Leu和N-Ac-L-Leu光学异构体的含量测定,分析健康人和糖尿病患者唾液中Ac-D,L-Leu定量值与D/L的变化,考察糖尿病诊断中的有效性。方法:以 N-acetyl-L-norleucine（Ac-L-Nle,IS）为内标物,将 N-Ac-D-Leu 和 N-Ac-L-Leu 与荧光衍生化学试剂（R）-（-）-4-（N,N-dimethylaminosulfonyl）-7-（3-aminopyrrolidin-l-yl）-2,1,3-benzoxadiazole[（R）-（-）-DBD-APy]进行衍生化反应。使用反相色谱柱进行分离,利用UPLC-FL（荧光）进行衍生化产物的检测,对手性拆分分析条件进行优化,最终筛选出最佳分离条件、检测灵敏度以及线性关系。将优化后的分析条件应用于健康人和糖尿病患者唾液中,进行Ac-D,L-Leu定量分析及D/L的比较。结果:UPLC-FL优化条件为流动相A:0.1%甲酸水溶液;流动相B:0.1%甲酸-甲醇和乙腈（40:60）混合溶液,以B=35%溶液等度洗脱15 min,Ac-D-Leu和Ac-L-Leu分离度为1.93,达到了完全分离。并且Ac-D-Leu和Ac-L-Leu在10-300μM范围内线性关系良好（R2≥0.9999）,检测灵敏度分别为0.004pmol和0.01 pmol。Ac-D-Leu和Ac-L-Leu的平均回收率分别为104.68%和102.48%;日内、日间精密度范围分别为3.36-5.96%和3.32-7.39%。使用本方法检测了 39名健康人唾液中Ac-D-Leu和Ac-L-Leu的含量,结果显示健康女性唾液中Ac-D-Leu和Ac-L-Leu 的平均含量分别为 21.07±14.98pmol/mL 和 21.96±19.41 pmol/mL;而在健康男性中的平均含量分别为54.95±51.73 pmol/mL和34.81±52.37 pmol/mL。检测16名糖尿病患者唾液中Ac-D-Leu和Ac-L-Leu的含量,结果显示女性糖尿病患者的Ac-D-Leu和Ac-L-Leu平均含量分别为12.32±9.04 pmol/mL和10.82±4.19pmol/mL;而在男性糖尿病患者中的平均含量分别为25.62±20.20和10.55±6.91 pmol/mL。健康人唾液中Ac-D-Leu和Ac-L-Leu的平均含量分别是29.99±32.30pmol/mL 和 25.35±31.22 pmol/mL,均高于糖尿病患者（分别为 19.48±16.41 pmol/mL和10.68±5.52pmol/mL）;健康人唾液中Ac-D-Lue的平均含量约为糖尿病患者的1.54倍,健康人唾液中Ac-L-Lue的平均含量约为糖尿病患者的2.37倍。根据Ac-D-Leu和Ac-L-Leu含量计算D/L比值,发现男性D/L平均值高于女性,并且健康人D/L平均值高于糖尿病患者。结论:通过对手性拆分分析条件的优化,可有效分离Ac-D-Leu和Ac-L-Leu。本方法对健康人唾液中Ac-D-Leu和Ac-L-Leu含量的检测,证实优化后的分析方法灵敏度高且重现性好。男性唾液中Ac-D-Leu和Ac-L-Leu的平均含量均高于女性,健康人唾液中Ac-D-Leu和Ac-L-Leu的平均含量均高于糖尿病患者,并且本方法可用简便的D/L比值反映Ac-D-Lue和Ac-L-Lue的定量结果。
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