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越橘的果实富含碳水化合物及多种微量元素,具有多种生理活性功能。在自然界中,越橘根系一般会与真菌共生形成菌根,其可促进越橘对营养和水分的吸收,增加越橘对环境胁迫的抵抗能力。侵染越橘的菌根真菌为内生菌根真菌,专性寄生杜鹃花科植物,被称为杜鹃花类菌根真菌(Ericoid mycorrhizal fungi,EMF)。大量研究显示MicroRNA(miRNA)在菌根形成过程中起着重要作用,为挖掘菌根共生相关miRNA并了解其作用机制,本研究从菌根侵染过程中差异表达的miRNA入手,分析其靶基因功能以及miRNA对其靶基因的调控作用;并通过miRNA过表达及沉默策略分析miRNA前体功能。研究结果如下:(1)以越橘组培苗为材料,对越橘根系接种杜鹃花类菌根真菌Cryptosporiopsis ericae菌株ZE103;对未接种及接种一、二、三周的越橘毛根组织实施转录组测序。对过滤后的转录组原始数据进行挖掘,筛选出9种差异表达miRNA的靶基因Unigene。对149个miRNA靶基因的GO富集分析显示,miRNA靶基因主要富集于细胞(Cell)、细胞结构(Cell part)、细胞器(Organelle)、细胞进程(Cellular process)、结合(Binding)五个亚类;KEGG通路分析显示miRNA靶基因主要参与某些蛋白加工及剪接体的形成;9种miRNA靶基因功能主要分布于菌根形成、耐寒、侧根发育、调节SPL转录因子等。大多数情况下,miRNA靶基因表达量随匹配miRNA频率的增加而表现出下降趋势。(2)从转录组表达序列标签(Expressed Sequence Tags.ESTs)中预测9种差异miRNA的前体序列。通过PCR及克隆测序获得9种miRNA的前体(pre-miRNA)序列。结构分析表明9种pre-miRNA存在发夹环,而miRNA在其中一条臂上,呈现出典型的pre-miRNA茎环结构。此外,多序列比对表明,pre-miRNA在不同物种中的保守性较低,而miRNA在不同物种中的保守性较高。进化分析结果显示,pre-miR159a与毛果杨、甜橙中前体序列亲缘关系较近,与亚麻芥、短柄草等草本植物的亲缘关系较远。实时荧光定量PCR结果表明一些pre-miRNA在越橘根、茎、叶的相对表达量均不同;9种pre-miRNA 中,pre-miR157、pre-miR7122a 及 pre-miR535d 在根中表达量较高,pre-miR1 66a,pre-miR162a、pre-miR1 68a 以及 pre-miR156 在茎中表达量较高,而 pre-miR396b 和 pre-miR159a在叶中表达量较高。(3)以pYBA-1132载体为模板,分别构建miR157a-5p及miR535d过表达和沉默载体,通过农杆菌介导将载体转化到越橘愈伤组织细胞中。经转化植株培育后,比较miRNA过表达及沉默植株的生长状态。miR157a-5p过表达的幼苗生长状况较正常植株及miR157a-5p沉默的幼苗植株更好,且越橘根系的生长情况和幼苗生长状况大致相似。而在miR535d过表达实验中,miR535d过表达及沉默植株的幼苗株高及鲜重均小于正常植株,而miR535d过表达植株的根系生长情况则相对较好。利用实时荧光定量PCR技术对miR535d、miR157a-5p及其靶基因在各植株中相对表达进行了分析,结果显示,过表达植株中rmRNA有表达量上升的趋势,而相对的靶基因富集程度降低;沉默植株中miRNA的表达量则显著降低。对miR157a-5p转化植株的生长及生理指标检测发现,低表达植株长势较差,抗逆相关生理活性物质活性下降,且严重滞后了菌根形成。miRNA高表达植株的抗逆相关生理活性物质含量升高,并提高了菌根形成效率。