第一部分EV71感染患儿T、B淋巴细胞表达水平研究　　肠道病毒71型（EV71）是引起手足口病（HFMD）及HFMD患儿神经及呼吸系统等并发症的主要病原体。EV71病毒感染严重的患儿可出现永久性的神经系统并发症甚至死亡。EV71病毒是继脊髓灰质炎病毒后最主要的嗜神经性病毒。近年来我国 HFMD疫情呈明显上升趋势，重症病例不断增加。同时由于 HFMD一旦在儿童密集地区爆发传染率极高，重症 HFMD病情变化极快，且伴随严重并发症，因此受到社会各界的高度关注。目前EV71病毒感染的致病机理仍未明确，尚未见针对HFMD的有效疫苗和抗病毒药物，但是众多实验数据表明，HFMD患者的免疫功能存在异常，HFMD的发病及疾病的严重程度与 T淋巴细胞、B淋巴细胞等免疫细胞的表达及功能密切相关。目前国内外少数研究显示 EV71病毒感染可导致机体免疫功能紊乱，但对于免疫应答在 EV71病毒感染发病中的具体作用机制尚不清楚，既往关于EV71病毒感染患儿T细胞和B细胞亚群的研究以及各亚群间相互关系的研究极少，因此研究这两类细胞亚群在 HFMD发病中的作用机制以及各细胞亚群间的相互关系，可深化对 HFMD发病机制的认识，为其临床诊治以及判断预后提供新的思路。　　目的：分析 EV71感染患儿外周血中 T细胞亚群（Th1、Th2、Th17、Treg、Tc1、Tc2、Tc17、Tfh、IL-21+CD3+CD8+）的表达水平，T细胞亚群的特征性转录因子的表达水平，探讨T细胞亚群之间、T细胞亚群与转录因子间的相互关系，以及它们在HFMD中的发病机制及作用；了解 EV71感染患儿外周血中 B淋巴细胞及 B10细胞的表达水平，确定 EV71感染患儿外周血 B10（IL-10+CD19+）细胞的负向免疫调节功能，探讨其在EV71感染患儿中的重要作用及临床意义。　　方法：研究对象为2014年11月至2015年7月广州市妇女儿童医疗中心收治的EV71感染患儿32例，手足口病诊断均符合卫生部制定的《手足口病诊治指南（2010年版）》诊断标准，咽拭子 EV71病毒核酸检测及 EV71病毒培养阳性并排除其他儿童常见病原体感染。对照组32例，咽拭子 EV71病毒核酸检测阴性，收集64例实验对象的临床资料及外周血标本。利用流式细胞术观察患儿外周血单个核细胞(PBMC)中 T细胞亚群（ Th1、Th2、Th17、Treg、Tc1、Tc2、Tc17、Tfh、IL-21+CD3+CD8+）的表达水平，B淋巴细胞及B10细胞的表达水平；利用RT-PCR方法分析EV71感染患儿及健康对照者外周血中 T-bet、Gata3、RORγt、Foxp3、TCF-1、Bcl-6 mRNA的表达水平。数据分析用SPSS18.0统计学软件分析，两组间比较正态分布时采用t检验，数据以均值±标准差（ X±S）表示，检验水准α=0.05，P<0.05为差异有统计学意义。方差不齐性或数据不服从正态分布时,釆用非参数检验中的 Mann-Whitney U检验,结果表示为均值及四分位数间(25％-75%)。P<0.05为差异具有统计学意义。相关性分析应用 Pearson相关性检验。　　结果：与对照组相比，EV71组 CD3+T、Th（CD3+CD4+）、Tc(CD3+CD8+)细胞明显下降； EV71组 Th1（ IFN-γ+CD3+CD4+）、 Tc1(IFN-γ+CD3+CD8+)、Treg(CD4+CD25hiCD127low)与对照组相比明显降低，Th2（IL-4+CD3+CD4+）、Tc2（IL-4+CD3+CD8+）、Th17（ IL-17+CD3+CD4+）、Tc17（ IL-17+CD3+CD8+）、Tfh（ IL-21+CD3+CD4+）、IL-21+CD3+CD8+、CD19+、B10(IL-10+CD19+)细胞与对照组相比明显升高；与对照组相比 EV71组 RORγt、Bcl-6、TCF-1的 mRNA表达量升高， T-bet、Gata3、Foxp3的 mRNA的表达量降低；EV71组中 Thl与 Treg、Tfh与 IL-21+CD3+CD8+、Thl7与 Tfh、Treg与 Thl7细胞表达在 EV71组中呈正相关关系，在对照组中无相关性； Thl与中性粒细胞、Th2与Treg细胞在EV71组中表达呈负相关关系，在对照组中无相关性；Thl与 Tc1、Thl7与 RORγt表达在 EV71组和对照组均呈正相关关系；EV71感染患儿外周血中 Th1/Th2比值较对照组明显下降,Th17/Treg比值较对照明显升高。　　结论：　　1. EV71感染患儿外周血 T淋巴细胞表达总体下调，在 T淋巴细胞亚群中 Th2、Tc2、Th17、Tc17、Tfh、IL-21+CD3+CD8+细胞表达上调，Th1、Tc1、Treg细胞的表达下调，说明各T细胞亚群在EV71病毒的致病过程中各自发挥不同的作用。　　2. EV71感染患儿B淋巴细胞及B10细胞表达上调，提示B淋巴细胞及B10细胞可能与HFMD的病情进展有关。　　3. EV71感染患儿存在Th1/Th2和Th17/Treg的比值失调,这种失调可能在感染的病理生理过程中起作用。　　4. EV71感染患儿Thl与Treg、Tfh与IL-21+CD3+CD8+、Thl7与Tfh、Treg与Thl7细胞表达呈正相关关系，Thl与中性粒细胞、Th2与 Treg细胞表达呈负相关关系，说明这些细胞亚群间相互影响，彼此联系。　　5. EV71感染患儿转录因子 T-bet、Gata3、Foxp3、RORγt、TCF-1、Bcl-6的 mRNA表达量存在异常，提示其可能在转录水平影响机体的抗病毒反应。　　第二部分甲型H1N1流感肺炎患儿NO、IFN-γ及IL-17表达水平研究　　甲型 H1N1流感病毒可引起一种新型呼吸道传播疾病。通过飞沫、气溶胶、直接接触或间接接触传播,临床主要表现为流感样症状,少数病例病情重,进展迅速,可出现病毒性肺炎,合并呼吸衰竭、多脏器功能损伤,严重者可以导致死亡。自2009年3月暴发于墨西哥后，迅速在全球范围内蔓延。由于流感病毒的变异性大，感染后发病率高、传染性强，严重威胁着人类的健康。　　目的:本文通过探讨甲型H1N1流感肺炎患儿一氧化氮（nitric oxide，NO）含量及细胞因子水平与机体免疫状态的关系及其检测的临床意义。总结其特点，以期为甲型H1N1流感肺炎的诊治提供一定的实验依据　　方法:2009年7月至12月于广州市妇女儿童医疗中心住院的甲型H1N1流感肺炎患儿，发病初期（3天内）采集咽拭子，应用荧光定量 RT-PCR法检测其感染病原学情况，选取甲型H1N1流感病毒（influenza AH1N1virus）阳性且未合并其它儿童常见病原体感染的肺炎患儿30例为病例组；同期保健门诊体检儿童30例为对照组，RT-PCR法检测其H1N1及儿童常见病原体核酸阴性。所有入组儿童留取血清及 EDTA抗凝全血标本，应用 Griess法测定各组儿童血清总 NO和亚硝酸盐（NO2-）含量；ELISA法检测各组儿童血清细胞因子IFN-γ及IL-17水平；并采用四色流式细胞术对两组儿童进行外周血淋巴细胞各亚群检测。　　结果:甲型H1N1流感肺炎患儿血清中总NO含量、NO2-水平及IL-17水平较对照组均显著升高（P<0.01），差异有统计学意义；而血清IFN-γ水平与对照组相比有所降低，但未见统计学差异（P>0.05）。另外，甲型H1N1流感肺炎患儿外周血CD3+、CD3+CD4+ T淋巴细胞比例以及CD56+CD16+ NK细胞比例均明显下降（P<0.05）；CD19+ B淋巴细胞比例则显著升高（P<0.01）；而CD3+CD8+T淋巴细胞以及CD4-CD8--双阴性（double negative，DN）T细胞比例则未见统计学差异（ P>0.05）。相关性分析显示，血清总NO含量与IL-17水平呈正相关（ P<0.01）。　　结论:甲型H1N1流感肺炎患儿机体存在NO及细胞因子IL-17水平的异常，可能与机体的淋巴细胞免疫功能紊乱有关；NO及细胞因子水平的异常可能是免疫因素导致肺部损伤的重要原因之一，病程中的监测对评估患者预后有一定的临床价值。