揭示自然现象发生发展过程的规律是自然科学研究的本质。害虫或害螨对杀虫剂或杀螨剂产生抗性的现象存在已久,其中害螨更是发展成为抗性问题最突出的节肢动物。众所周知,抗性发生发展过程中,伴随着大量基因的表达发生变化。但是,长期以来,人们除对某个（类）基因表达变化与抗性发展的关系研究较多外,对整个抗性上升过程中,基因的整体变化规律并不清楚。从整体上揭示抗性发展过程中基因表达的变化规律,将有助于从分子层面解析抗性不断上升的原因,进而结合变化规律,筛选出潜在的抗性分子标记,为抗药性的治理提供理论依据和技术支撑。低成本、高通量转录组测序技术的发展为了解大量基因的动态变化提供了可能。因此,本研究以朱砂叶螨和丁氟螨酯为研究对象,通过转录组测序技术揭示朱砂叶螨对丁氟螨酯抗性发展过程中基因表达的变化规律,解析抗性上升的内在分子机制,探索抗性分子标记的早期快速鉴定方法。主要研究结果如下:1.朱砂叶螨对丁氟螨酯的抗性筛选和代谢抗性机制从朱砂叶螨云南敏感品系（YN-S）分出一亚品系开始筛选抗性,命名为云南丁氟螨酯抗性品系（YN-Cy R）。经丁氟螨酯连续筛选32代后,YN-Cy R的LC50由1.15 mg/L上升到98.96 mg/L,抗性倍数达到86.05倍。根据抗性水平分级标准,筛选至16、25和32代（YN-Cy R＿16、YN-Cy R＿25和YN-Cy R＿32）时抗性水平分别达到低抗、中抗和高抗水平,简写为L、M和H。对YN-S品系和YN-Cy R品系H阶段进行丁氟螨酯作用靶标线粒体复合物Ⅱ（SDH）的突变检测、解毒酶活性测定和增效剂生物测定,明确朱砂叶螨对丁氟螨酯的抗性机制。相比于YN-S品系,H阶段的抗性朱砂叶螨的5条SDH亚基在氨基酸水平均未发生突变;P450s和GSTs粗酶的比活力分别显著升高至2.62倍和1.20倍,CCEs粗酶的比活力无显著变化;增效剂PBO和DEM对抗性朱砂叶螨的增效作用显著,增效比分别为3.10和1.85,并且可以分别消除60.11%和40.35%的抗性,DEF无明显增效作用。结果表明,代谢抗性是朱砂叶螨对丁氟螨酯的主要抗性机制,P450s是介导朱砂叶螨丁氟螨酯代谢抗性的主要酶系。2.朱砂叶螨对丁氟螨酯抗性发展过程中基因表达的变化规律利用转录组技术分析抗性发展过程中差异表达基因（DEGs）的数量、差异表达程度和功能富集,明确基因随抗性上升的变化规律。L、M和H三个抗性阶段的DEGs总计有4559条。随着抗性水平持续上升,DEGs数量逐渐增多,抗性水平从L发展到M再到H,DEGs数量从2911条增加至3359条再增加至3556条:其中,只分别在L、M和H阶段特有的DEGs各有226、584和657条,而在三个阶段都共有的DEGs有2175条,约占总DEGs的一半（47.71%）。L、M和H三个阶段上调表达基因的上调幅度（上调倍数的中位数）分别为4.38、4.11和4.26,下调表达基因的下调幅度（下调倍数的中位数）分别为-2.79、-2.68和-2.73,显示出抗性发展过程中DEGs的表达整体较为稳定。三个阶段共有的2175条DEGs中有1685条（77.47%）上调表达:391条（23.20%）的表达持续上升,上调幅度从L阶段的4.26上升至M阶段的5.24,再上升至H阶段的6.73;1148条（68.13%）的表达相对稳定,上调幅度维持在5.24左右;146条（8.67%）DEGs表达的上调幅度呈下降趋势,从6.11降至5.66再降至4.32。功能富集分析表明,L、M和H三个抗性阶段的DEGs的功能均显著聚集于溶酶体、解毒代谢、信号传导和转录调控功能。解毒酶基因的上调表达是代谢抗性形成的重要因素,因此重点分析了上调表达解毒酶基因在三个抗性阶段的变化规律。分析结果表明,朱砂叶螨四类解毒酶基因（P450s,GSTs,CCEs和ABCs）随丁氟螨酯抗性上升的动态变化规律与整体基因的变化规律一致,比如,上调表达的解毒酶基因的大多数（78.86%）在三个阶段都上调表达,而上调表达基因中稳定表达的基因占多数（76.29%）,其次是持续上调表达（14.43%）和上调幅度下降的基因（9.28%）。值得一提的是,上调表达的解毒酶基因以P450s基因数量最多（总计40条,占上调表达解毒酶基因的33.06%）,并且随着抗性持续上升,数量逐渐增多,上调幅度也持续增大。同时,一条P450基因在三个阶段的上调倍数（CYP392A1,855.23、538.23和699.64倍）都远高于其它解毒酶基因的上调倍数。由此揭示出P450基因在朱砂叶螨对丁氟螨酯抗性形成中具有重要作用。综上所述,朱砂叶螨对丁氟螨酯抗性发展过程中,基因的动态变化规律为:（1）随抗性水平不断上升,差异表达基因数量逐渐增多;（2）整个抗性阶段都差异表达的基因多于只在特定抗性阶段差异表达的基因;（3）整个抗性阶段都差异表达的基因以上调表达为主,并且多数基因上调表达稳定,少数上调表达幅度持续增大,更少数上调幅度持续下降。由此可做出推论:包括解毒酶基因在内的、从低抗水平阶段就稳定上调表达的基因是差异表达基因的主体,它们构成了代谢抗性的基础;整个抗性发展过程中都持续上调表达的基因和阶段性新增的上调表达的基因,是推动抗性持续升高的主要驱动力。3.朱砂叶螨丁氟螨酯抗性基因的功能验证选择抗性发展过程中持续上调表达的7条基因（6条解毒酶和1条新基因）、稳定上调表达且上调倍数最高的解毒酶基因（CYP392A1）和稳定上调表达且表达量最高的解毒酶基因（GSTd05）各1条,在YN-Cy R品系H阶段验证它们在抗性中的功能。RNAi的结果为,在9条基因的干扰效率为47.44%-64.03%情况下,丁氟螨酯对朱砂叶螨的致死率提升了4.86%-26.31%(诊断剂量为LC50),基因被干扰后死亡率提升由高到低的顺序为:CYP392A1、GSTd05、CCE06、CYP389A1、Tc03g09640、GSTz01、CCE59、CYP389C2和CYP392E6,暗示着9条基因不同程度地参与了朱砂叶螨对丁氟螨酯代谢抗性的形成。将CYP392A1、CCE06和CYP389A1作为代表基因（GSTd05已被研究）进一步验证其对药剂的代谢功能。通过原核表达获得了3个基因编码的重组蛋白,其对特异性底物的催化活性分别为0.77 nmol/mg pro/min、517.14 nmol/mg pro/min和0.23 nmol/mg pro/min,丁氟螨酯对三个重组蛋白的抑制中浓度IC50分别为124.49μM、172.25μM和218.36μM,表明重组蛋白都具有酶活性,并且都能与丁氟螨酯结合。HPLC的结果表明,20μg的重组蛋白CYP392A1、CCE06和CYP389A1对丁氟螨酯的代谢率分别为34.61%、17.75%和12.83%;重组蛋白CYP392A1和CYP389A1独立发挥代谢丁氟螨酯的作用,二者混合无代谢增效效应。4.快速获得抗性分子标记的方法的探索解毒酶基因被认为是经典的抗性基因,因此,可将在抗性上升中持续上调表达和稳定上调表达的解毒酶基因作为丁氟螨酯的抗性分子标记。通过对高剂量一次筛选YN-S品系(LC80的剂量杀死约80%的YN-S品系,存活个体产生的F1代)和不同浓度诱导YN-S品系(使用LC20、LC50和LC80三个浓度分别诱导YN-S品系1.5 h后收集样品)进行转录组测序和比较差异表达基因,并与长期抗性筛选获得的抗性分子标记联合分析,探索早期快速获得抗性分子标记的方法。与对照（丙酮处理）相比,三个浓度的丁氟螨酯诱导处理后DEGs的数量分别为184条,66条和75条,明显少于高剂量一次筛选（YN-S-S VS YN-S）后DEGs的数量（1788条）;丁氟螨酯诱导和高剂量一次筛选后上调表达基因的上调幅度分别为1.80、2.16、1.84和3.14,下调表达基因的下调幅度分别为-0.79、-0.77、-0.67和-1.29,表明高剂量一次筛选后基因的变化幅度要大于药剂短期诱导后的变化幅度。将丁氟螨酯诱导和高剂量一次筛选获得的上调表达的解毒酶基因与已知的丁氟螨酯抗性分子标记联合分析,发现诱导处理中只出现了2条抗性分子标记(LC20诱导后ABCG11和GSTm03上调表达),高剂量一次筛选后上调表达的DEGs中出现了16条抗性分子标记,其中的GSTm04、CYP392A1和CYP392E6已被证明与朱砂叶螨丁氟螨酯代谢抗性有关。因此,将高剂量一次筛选后形成的上调表达的解毒酶基因作为分子标记,可能发展成为一种早期快速获得抗性分子标记的方法。