SUMO（Small Ubiquitin-Related Modifier）是类泛素样小蛋白质的总称，因与泛素具有相似的空间结构和作用方式而得名，广泛存在于真核生物中，对基因的表达、染色体的损伤修复和重组及蛋白质的稳定性、细胞内定位等都有调节作用。蛋白质的SUMO化修饰是一个可逆的过程。SUMO经特异性蛋白酶切割转变为活性形式后，在ATP提供能量的情况下，经激酶E1（Sae1/Sae2异二聚体）、结合酶E2（Ubc9）、连接酶E3（体外实验通常不需要）的催化，可与底物蛋白通过共价键相连而使底物蛋白被修饰。本实验以大肠杆菌作为反应器，将SUMO化需要的E1、E2和Sumo构建至表达载体转入大肠杆菌中，构成Sumo化修饰系统，将SUMO底物Oct4转入到该系统中，检验系统的修饰功能，得到了被SUMO化修饰的Oct4蛋白，证明构建的修饰系统是有效的。我们以大肠杆菌这个天然系统为背景构建的Sumo化修饰系统便于获得Sumo化的蛋白，为研究蛋白质的Sumo化修饰奠定了基础。（1）表达载体pGEX-Oct4、pGEX-Oct4^k118R、pCDF-Sae2-Sae1、pACYC-Ubc9-Sumo1的构建:采用NCBI数据库中提供的Sae1、Sae2、Ubc9、Sumo1以及Oct4的序列，设计带酶切位点的特异性引物；用Trizol裂解法从小鼠畸胎瘤细胞F9中提取总RNA，反转录为cDNA，用特异性引物从cDNA中扩增得到各目的条带。将Sumo化修饰所需要的酶E1（Sae1/Sae2）构建至表达载体pCDFDuet-1，构成双表达载体pCDF-Sae2-Sae1。E2（Ubc9）和Sumo1构建至载体pACYCDuet-1，构成双表达载体pACYC-Ubc9-Sumo1。实验所采用的Sumo修饰底物为Oct4，118位赖氨酸突变为精氨酸的突变体Oct4^k118R作为对照与Oct4分别构成含有GST标签的表达载体pGEX-Oct4和pGEX-Oct4^k118R。测序验证实验成功构建了四个表达载体。（2）载体蛋白的诱导表达:将测序正确的重组质粒分别转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，获得含重组质粒的表达菌株。经终浓度为1mmol/L的IPTG28℃诱导后，收集菌体，SDS-PAGE或Western Blot检测蛋白表达情况。从SDS-PAGE电泳中检测到了Sae1、Ubc9、Sumo1蛋白的表达条带，在Western Blot中检测到了Sae2的蛋白表达条带。Oct4和Oct4^k118R蛋白也正常表达。（3）Sumo化修饰系统的构建:双表达载体pCDF-Sae2-Sae1和pACYC-Ubc9-Sumo1共转入大肠杆菌BL21，构成蛋白质Sumo化修饰系统。载体pACYC-Ubc9-Sumo1转化BL21感受态细胞，利用氯化钙感受态细胞制备法将含有pACYC-Ubc9-Sumo1的菌株制备成感受态细胞，载体pCDF-Sae2-Sae1转化此感受态细胞，获得含有pACYC-Ubc9-Sumo1和pCDF-Sae2-Sae1双质粒的表达菌株，此菌株即为我们构建的Sumo化修饰系统。（4）Sumo化修饰系统的功能验证：底物Oct4的Sumo修饰。将表达载体pGEX-Oct4^k118R和pGEX-Oct4分别转入Sumo化修饰系统，构建成同时含有pGEX-Oct4/pGEX-Oct4^k118R、pCDF-Sae2-Sae1、pACYC-Ubc9-Sumo1三质粒的共表达菌株。IPTG诱导三质粒共表达菌株后，Oct4抗体杂交，WesternBlot检测到了Sumo-Oct4蛋白条带。（5）Sumo化修饰系统遗传稳定性检测:对含有pGEX-Oct4、pCDF-Sae2-Sae1、pACYC-Ubc9-Sumo1的共表达菌株连续传代。每传一代，都提取质粒，分别用Sumo1，Sae2，Oct4特异性引物PCR检测三个质粒是否同时存在，在连续传了15代后，仍能检测到目的片段。说明我们构建的系统稳定性良好。