[研究背景] 鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是一种常见的恶性肿瘤，好发于中国南方，尤以广东省最多见。15年来发病率和死亡率一直居高不下(发病率：9.83-11.88/10万，死亡率：10-13/10万)。目前鼻咽癌病因尚不明确，无确实可行的一级预防措施，故对鼻咽癌的防治目前主要寄希望于二级预防。筛查作为恶性肿瘤二级预防的主要手段在鼻咽癌的防治中作用重大，通过筛查，我们可以早期发现，早期诊断和早期治疗鼻咽癌，使鼻咽癌患者的5年生存率得到显著提高。因此寻找一种高效，方便快捷，经济的鼻咽癌筛查手段是十分重要且迫切的。 自1967年Helen在鼻咽癌病人的血清中发现EB病毒(Epstein—barr virus，EBV)特异性IgA抗体，1969年由鼻咽癌活检组织培养出的类淋巴母细胞中分离到EB病毒以来，大量研究结果表明EB病毒是鼻咽癌重要的诱发因子，并且在鼻咽癌患者体内经常存在升高的抗EB病毒不同抗原的特异性抗体。长期以来EB病毒感染的血清学检测就被用作鼻咽癌早期诊断的重要手段被广泛应用，其中对诊断鼻咽癌最具意义的EB病毒蛋白主要有：EB病毒壳抗原(VCA)，早期抗原(EA)，核心抗原(NA1)和潜伏膜蛋白2A(LMP2A)等。 EB病毒早期抗原(early antigen，EA)对鼻咽癌的诊断最具特异性，被认为是鼻咽癌特异性的标志，抗IgA/EA抗体的检测长期以来就被作为诊断鼻咽癌的辅助指标。EA是EB病毒早期抗原(early antigen)的缩写，由EB病毒早期弥散型抗原(EA—D)和局限型抗原(EA—R)两种物质组成的复合物，但在鼻咽癌患者血清中EA抗原IgA类抗体主要是与D型EA产生特异性反应，因此有的学者认为建立D型EA为主的EA抗原IgA类抗体的血清学检测手段对提高鼻咽癌早期诊断的准确率十分的重要。早期抗IgA/EA抗体检测的方法主要有免疫荧光法(fluoroimm unoassay，FIA)，免疫酶法(immunoenzymatic assay，IE)等，但是由于操作繁琐，特异性差且需要特殊仪器，结果读取存在主观差异等缺点给鼻咽癌的筛查带来一定的困难。ELISA作为一种新型的检测方法克服了以上缺点显示出极大的优越性受到人们的关注，逐渐被许多学者应用和探讨。 [研究目的] 针对目前抗IgA/EA抗体检测的ELISA试剂盒中尚无EA抗原以真核表达产物作为包被抗原者，作为对现有试剂盒的改进，本实验构建EA—D(P54)的真核表达载体并在毕赤酵母中进行分泌表达。以纯化的重组蛋白建立初步间接ELISA方法，开发鼻咽癌早期诊断试剂盒，用于鼻咽癌的大规模筛查。 [研究方法] 培养细胞B95-8，提取EB病毒基因组DNA作为扩增模板，设计一对引物扩增BMRF1基因片段编码区域序列；构建重组质粒PpICZα A—BMRF1；电转入毕赤酵母GS115，筛选His+ Mut+表型转化子并用甲醇诱导表达；饱和硫酸铵分级盐析纯化目的蛋白；纯化目的蛋白做Western—blot检测免疫活性；并包被酶标板，建立抗IgA/EA—D抗体的ELISA检测方法；收集300例鼻咽癌患者和200例健康对照人群血清，进行检测并对检测结果做统计学分析。主要步骤入下： 1.B95-8细胞的培养及其基因组DNA的提取 B95-8细胞用含有10％FCS，100U/ml青霉素和100ug/ml链霉素的RPMI-1640培养液，在37℃，5％CO2条件下培养，每周换液两次。收取对数增殖期细胞，采用传统的酚—氯仿—异丙醇方法提取其基因组DNA，用灭菌水溶解，于—20℃保存备用。 2.PCR扩增目的片段 按照GenBank发表的B95-8细胞中EB病毒株BMRF1基因片段编码区的参考序列，以及载体pPICZα A的多克隆酶切位点，参考引物设计软件PrimerPrimer5.0设计一对引物： P1：5CGGAATTCATGGAAACCACTCAGAC3含Eco RⅠ酶切位点； P2：5GCGGATCCGATGGTGTTAATTGAGG3’含KpnⅠ的酶切位点；以EB病毒基因组DNA作为模板PCR扩增目的片段。 3.重组质粒的构建与鉴定 胶回收PCR产物，并与载体pPICZα A分别用Eco RⅠ和KpnⅠ双酶切后琼脂糖凝胶电泳，回收后T4DNA连接酶4℃连接过夜，将过夜连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态，在含Zeocin(终浓度25ug/ml)的低盐LB平板上筛选阳性克隆，提取质粒，做双酶切电泳鉴定及DNA测序。 4.重组质粒电转酵母细胞 鉴定正确的重组质粒用SacⅠ内切酶线性化并电转入GS115酵母细胞，于含Zeocin(终浓度100ug/ml/)的YPDS平板上筛选。所得阳性克隆用MMH板和MDH板筛选Mut表型，筛选在MMH和MDH平板上生长均良好的Mut+表型菌株作为表达菌，同时将筛选好的表达菌破壁做PCR扩增进一步鉴定转化子。 5.重组蛋白的诱导： 将鉴定好的表达菌挑取少量，接种于BMGY中培养增菌，待A600达到2-6(约16-18小时)，换入1/5体积的BMMY液体培养基中，以0.5％的甲醇终浓度诱导表达24、48、72、84、96小时。 6.重组蛋白的纯化及其浓度测定： 从诱导第24小时开始，于每个诱导时间每分别取少量上清点样做SDS—PAGE分析；并用诱导上清包被聚丙乙烯板条行间接ELISA检测，测定重组蛋白的抗原效价；于抗原效价最佳时回收上清，用0.22μ m的膜过滤后，经35％PEG(6000)，4℃透析浓缩；浓缩后的诱导上清进行饱和硫酸铵分级盐析，纯化目的蛋白，备用；并用BCA蛋白定量测定法测定重组蛋白溶液的最终浓度。 7.Westernblot检测重组蛋白的免疫学活性。 8.ELISA法检测鼻咽癌病人及其健康对照的血清 1)抗原包被量的确定： 选择方阵滴定确定最佳重组蛋白包被浓度。 2)临界值的确定： 选择ROC曲线法确定临界值。 3)灵敏度，特异度的计算： 灵敏度=A/(A+B)；特异度=D/(C+D)；其中A为鼻咽癌患者阳性例数，B为鼻咽癌患者阴性例数，C为健康人阳性例数，D为健康人阴性例数。 [研究结果] 构建了pPICZα A—BMRF1重组质粒；目的蛋白在毕赤酵母GS115中高效分泌表达；SDS—PAGE在58KD处显示有相应目的条带；同时Western—blot也证明其有良好的免疫活性；纯化目的蛋白行间接ELISA分别检测鼻咽癌患者与正常人群血清，显示有较佳的敏感性和特异性分别为92.7％和94.5％。 [研究结论] 毕赤酵母作为一种真核表达系统充分展现了其优越性，所表达外源蛋白不仅产量高，免疫活性好而且分泌表达杂质蛋白少利于纯化，可以为ELISA血清学检测方法的开展提供充足稳定高质的蛋白来源。 本实验尝试的抗IgA/EA—D抗体的ELISA检测方法在鼻咽癌血清学诊断上显示有较佳的特异性和灵敏性同时操作方便快捷，成本低廉，结果客观明确，适合于鼻咽癌的大规模筛查和早期诊断。