大豆[(Glycine max (L.) Merr.]作为油料作物和经济作物,在食品工业和农业生产中占有重要地位。大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus, SMV)病在世界范围内广泛分布并普遍发生,是导致大豆严重减产和种质衰退的病毒病害之一。这引起了国内外许多学者的科研兴趣,研究内容涉及SMV株系群划分与发生分布、传播流行方式、寄主上的症状和影响因素、基因组结构组成及各基因功能、植物生理生化抗性、大豆SMV抗性遗传育种等各方面。但是大豆抗性品种对大豆花叶病毒的抗性机制以及抗病基因的克隆等方面的研究还很少,本研究通过蛋白组学技术对大豆花叶病毒诱导下的叶片蛋白质进行鉴定,以期为抗病相关基因的克隆提供重要信息。1、大豆花叶病毒诱导下的大豆叶片差异蛋白组分析。首先研究了花叶病毒诱导后不同时间点上大豆叶片电导率变化。结果表明对照和接种感病株系的大豆叶片的电导率变化趋势十分相似。只是在接种48h时,接种感病株系叶片的电导率没有恢复到与未接-种时相近的数值,而对照和接种抗病株系的大豆叶片在此时都基本恢复到了初始的数值。总体来看接种抗病株系后与其他两种情况相比电导率变化更加明显,并且在4h和24h时电导率有最明显的区别,出现了两个峰值。这可能是因为诱导4h和24h这两个时间点上大豆响应大豆花叶病的胁迫反应强烈,可能在这两个时间点上大豆的抗病反应更加活跃。其次本研究利用双向电泳技术分析大豆品种“科丰1号”在接种SMV后与对照(接种磷酸缓冲液)相比,大豆叶片全部可溶性蛋白的表达差异。首先通过比较实验选取了3-10NL 17cm的IPG干胶条和银染的方法进行进一步的研究。双向电泳的实验每个处理选取三个重复,每张胶面上一般得到1200-1400个左右的蛋白点。然后利用双向电泳技术研究了接种病毒后与对照(接种磷酸缓冲液)相比在不同时间点(2h、4h、8h、12h、24h、48h)上大豆叶片可溶性蛋白的表达差异,经PDQuest软件分析得到了各个时间点上表达有差异的蛋白点。并且本研究还利用质谱分析的方法鉴定了接种4h时的25个差异表达的蛋白点,其中15个差异蛋白点在接种大豆花叶病毒株系JN17的样品中表达量上调,10个差异蛋白点表达量下调。共在数据库中搜索得到了19个点的结果,按照Bevan (Bevan et al.,1998) and Holmes-Davis (Holmes-Davis et al.,2005)的方法可以将这19个蛋白分成9类。这些蛋白主要与能量调节、代谢调节、次生代谢、蛋白质的合成降解、细胞结构、信号转导、抗病反应等生理过程相关。最后利用了荧光定量PCR的方法比较了双向电泳鉴定出来的差异蛋白点的编码基因在转录水平上的变化。除了两个未知蛋白外,分析了鉴定出来的其他15个同源蛋白,得到了13个蛋白编码基因的荧光定量PCR结果。在本研究中差异蛋白点在翻译水平和其编码基因在转录水平上的相关性不高,只有两个基因钙网蛋白和NADPH依赖的柠檬酸脱氢酶在转录水平和转录后翻译水平上呈现相同的变化趋势。另外还用荧光定量PCR的方法研究了这13个差异蛋白的编码基因在接种大豆花叶病毒JN17后不同时间点上在转录水平上的动态变化,它们分别呈现了各自特异性的变化趋势。2、本研究还利用蛋白质三级结构分析、亚细胞定位、大豆花叶病毒诱导表达以及转基因实验等研究初步探讨了两个单链特异性核酸内切酶GmENl和GmEN2基因与大豆抗大豆花叶病毒机制间的关系。分别将GmENl和GmEN2基因的氨基酸序列输入Swiss-model (www.swissmodel.expasy.org)服务器中进行同型分析建模分析。两个基因蛋白质的三级结构十分相似,且都是以桔青霉(penicillium citrinu)的核酸酶P1为模版进行同型建模的。本研究利用洋葱表皮细胞的瞬时表达系统对GmEN1和GmEN2的亚细胞定位进行了研究。通过农杆菌介导法转化洋葱表皮细胞,结果表明GmEN1定位在细胞核上,GmEN2基因定位在细胞膜上。本研究利用荧光定量PCR分析了GmEN1和GmEN2基因与大豆花叶病毒(SMV)胁迫的相关性。GmENl基因对于大豆花叶病毒的应答模式呈双峰,分别在0h-4h和8h-24h时表达量迅速增加,并在4h和24h时达到最高峰。而GmEN2基因对于大豆花叶病毒的胁迫的应答却没有GmENl基因那么迅速和强烈,接种4h前GmEN2基因的表达量没有变化,而在集中后期8h-48h期间GmEN2基因的表达量明显下降。本研究将GmEN1和GmEN2基因转化到pMDC83植物表达载体中,并通过农杆菌介导的烟草叶盘法转化烟草品种“三生烟”。在本研究中,采用PCR的方法鉴定出阳性转基因植株后,从两个基因PCR阳性的植株中分别选出三株的T1代幼苗又进行了基因水平的PCR鉴定和转录水平的荧光定量PCR鉴定,证实确实获得了含GmENl和GmEN2基因的转基因烟草阳性植株。进一步设计了水杨酸(SA)胁迫处理实验,发现WT和转GmEN1和Gm1 EN2基因的T1代幼苗经5mM SA处理后,都与WT有明显的差异,转基因的烟草幼苗明显长势比WT好,表现为WT幼苗在处理15天后大部分幼苗枯黄停止生长,而转GmENl和GmEN2基因的T1代幼苗生长基本不受影响,植株的大小和颜色都正常,且转基因植株的单株鲜重明显高于野生型烟草。说明转GmEN1和GmEN2基因烟草相对于野生型烟草而言对于水杨酸胁迫的耐受性更高一些。