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研究背景视网膜退行性疾病如年龄相关性黄斑变性(AMD)和视网膜色素变性(RP)可导致视力损害并最终不可逆性失明。视网膜缺血和光损伤被认为是这类疾病的两大主要原因。光感受器细胞死亡是视网膜退行性病变的基本病理特征。引起视网膜退行性疾病的机制可能是复杂的,涉及多种遗传和环境因素。目前虽然已经发现了数百种致病基因突变,但导致光感受器死亡的确切分子途径尚不完全清楚。由于视网膜的高氧耗和光敏性,视网膜特别容易发生氧化应激。线粒体对氧化应激具有一定的调节能力,但是当活性氧(ROS)超过细胞的抗氧化防御能力时,会启动程序性细胞死亡,即凋亡。caspase依赖途径是经典的凋亡途径,即活化一系列半胱氨酸蛋白水解酶,其可通过线粒体介导的内源性途径激活,也可通过受体介导的外源性途径激活。除了经典的caspase依赖途径,Parthanatos是一种独特的、高度编排的细胞死亡形式,它通过核酶PARP-1的过度激活而发生。Parthanatos不需要caspases来执行,而是依赖于PARP-1介导的PAR的积累以及随后凋亡诱导因子(AIF)的核易位,导致细胞死亡。白藜芦醇(RSV)是一种多酚类化合物,在许多植物中能够发现,如红葡萄、花生和桑树。白藜芦醇有多种药理作用,如抗氧化、抗衰老、抗炎、抗癌、保护神经和心血管系统等。白藜芦醇是SIRT1的激活剂,SIRT1是一种核酶,是哺乳动物sirtuins(SIRT 1-7)家族的成员,是一种NAD~+依赖的去乙酰化酶,在许多生物过程中发挥重要作用,包括代谢、发育、细胞存活和衰老等。到目前为止,还没有较好的临床策略来预防视网膜退化和恢复视觉功能。因此,研究延缓甚至阻止光感受器细胞死亡的方法是很有意义的。本研究在体外通过让661 W遭受葡萄糖剥夺和光损伤来模拟视网膜感受器神经元退行性死亡,探讨白藜芦醇在两种不同损伤条件下对661 W的影响及作用机制;在体外建立光损伤小鼠模型,探讨白藜芦醇对视网膜的保护机制及作用研究。方法1.检测白藜芦醇在葡萄糖剥夺和光损伤条件下对视网膜感光细胞的影响在正常培养条件下对661 W进行MMT检测,观察白藜芦醇的剂量-反应曲线及IC50;采用实时细胞阻抗监测不同浓度的白藜芦醇在葡萄糖剥夺和光损伤条件下对661 W的细胞活性影响;采用PI/Hoechst染色法观察白藜芦醇在两种不同损伤条件下对细胞凋亡情况的影响。2.检测白藜芦醇在葡萄糖剥夺和光损伤条件下对氧化应激及线粒体的影响氧化应激会产生过量的活性氧,采用DCFH-DA探针测定细胞内活性氧水平,观察白藜芦醇在两种不同损伤条件下对细胞内活性氧的影响;还原型谷胱甘肽(GSH)是ROS最重要的清除剂之一,其与氧化型谷胱甘肽(GSSG)的比值被认为是氧化应激的标志之一,采用GSH和GSSG试剂盒检测细胞内GSH/GSSG的水平,观察白藜芦醇在两种不同损伤条件下对细胞氧化还原状态的影响;HO-1是一种普遍存在的、氧化还原敏感的诱导应激蛋白,通过将血红素降解为一氧化碳(CO)、铁和胆绿素,可以发挥间接而有效的抗氧化作用,采用Western blot法检测白藜芦醇在两种不同损伤条件下对HO-1蛋白水平的影响;氧化应激会影响线粒体形态和功能,采用Mito-Tracker Green绿色荧光染色检测白藜芦醇在两种不同损伤条件下线粒体的形态变化;采用JC-1染色观察线粒体膜电位的变化,评估白藜芦醇在两种不同损伤条件下的线粒体功能。3.检测白藜芦醇在葡萄糖剥夺和光损伤条件下对SIRT1的影响白藜芦醇是SIRT1激活剂,使用SIRT1的抑制剂Ex-527并采用PI/Hoechst染色法观察RSV在两种不同损伤条件下对细胞凋亡情况的影响;采用Western blot法检测RSV在两种不同损伤条件下对SIRT1蛋白水平的影响;SIRT1是一种核酶,对各组核蛋白提取物采用SIRT活性/抑制分析试剂盒检测白藜芦醇在两种不同损伤条件下SIRT1酶活性的变化。4.检测白藜芦醇对葡萄糖剥夺和光损伤诱导的细胞死亡的保护机制caspase途径是经典的凋亡途径,使用caspase抑制剂z-VAD-fmk并采用PI/Hoechst染色法观察在两种不同损伤条件下对细胞凋亡情况的影响;除外caspase依赖途径,Parthanatos不需要caspases来执行,而是依赖于PARP-1介导的PAR的积累以及随后凋亡诱导因子(AIF)的核易位,导致细胞死亡,使用慢病毒sh-PARP敲低质粒转染661 W并采用PI/Hoechst染色法观察在光损伤条件下对细胞凋亡情况的影响;采用Western blot法检测RSV在两种不同损伤条件下对caspase-3,caspase-9,AIF和PARP-1蛋白水平的影响;5.检测白藜芦醇在光损伤条件下对小鼠视网膜的影响建立小鼠光损伤模型,采用ERG检测白藜芦醇在光损伤条件下对小鼠视网膜功能的影响;采用HE染色,观察白藜芦醇在光损伤条件下对小鼠视网膜ONL结构的影响;采用Western blot法检测白藜芦醇在光损伤条件下对AIF、PARP-1蛋白水平的影响。结果1.白藜芦醇的剂量-反映曲线表现为典型的“毒物兴奋效应”,白藜芦醇的半数抑制浓为209.6μM。在葡萄糖剥夺和光损伤条件下,10μM,50μM,100μM白藜芦醇对661 W细胞具有保护效果,并且存在剂量依赖性,100μM白藜芦醇保护效果最好。2.白藜芦醇能够降低葡萄糖剥夺和光损伤所致的ROS的产生,提高细胞内GSH/GSSG的比值及HO-1的蛋白表达水平,改善线粒体形态,提高线粒体膜电位。3.在葡萄糖剥夺和光损伤条件下,SIRT1抑制剂能够抑制白藜芦醇对两种不损伤的保护作用,白藜芦醇能够提高SIRT1蛋白表达水平和细胞核内SIRT1酶活性。4.在葡萄糖剥夺条件下,caspase抑制剂能够降低白藜芦醇对葡萄糖剥夺诱导的细胞死亡的保护作用,对光损伤诱导的细胞死亡无影响;白藜芦醇能够降低葡萄糖剥夺诱导的caspase-3,caspase-9的蛋白表达水平;在光损伤条件下,敲除PARP-1的细胞死亡数量明显减少,白藜芦醇能够降低光损伤诱导的AIF,PARP-1的蛋白表达水平。5.白藜芦醇能够改善光损伤所致的ONL变薄,增加a波b波振幅,提高视网膜AIF和PARP-1的蛋白表达含量。结论葡萄糖剥夺和光损伤引起细胞发生氧化应激,线粒体结构改变和线粒体功能障碍,并最终导致细胞死亡。白藜芦醇能够降低细胞内活性氧的产生,提高GSH/GSSG的比例,改善线粒体形态和膜电位,减少细胞死亡。使用caspase抑制剂和慢病毒介导的shRNA敲除PARP-1,提示葡萄糖剥夺和光损伤诱导的细胞死亡途径不同,白藜芦醇通过抑制caspase依赖途径保护葡萄糖剥夺诱导的细胞死亡,而白藜芦醇通过抑制PARP依赖途径保护光损伤诱导的细胞死亡。此外白藜芦醇能够提高SIRT1的蛋白表达及SIRT1酶活性,同时使用SIRT1抑制剂降低了白藜芦醇对葡萄糖剥夺和光损伤的保护作用,提示白藜芦醇的保护作用与SIRT1的活化有关。同时,白藜芦醇通过PARP-1依赖途径保护光损伤所致的小鼠视网膜外核层变薄,改善视网膜功能。综上所述,白藜芦醇对葡萄糖剥夺和光损伤均具有神经保护作用。