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泛素介导的26S蛋白酶体降解途径在植物抗逆境胁迫和激素相关的信号转导中起着重要的作用。已知拟南芥中含有环指蛋白结构域的E3泛素连接酶SDIRl是植物逆境胁迫相关的激素ABA信号途径的正调控因子。ECA1是以SDIR1为诱饵,从拟南芥cDNA筛选得到的相互作用蛋白,其生化功能为ER膜上的ATPase Ca2+泵。本论文通过生物化学、分子细胞生物学和遗传学分析等方法对ECA1与SDIR1的相互作用,以及SDIR1/ECA1复合体参与的生理过程和该蛋白在植物逆境胁迫相关的激素ABA信号途径中的调控机制进行了深入的研究和阐述。
利用膜蛋白酵母双杂交系统和体外的pull-down实验验证了ECA1与SDIR1蛋白的相互作用;并通过体外泛素化反应验证了SDIR1介导ECA1的泛素化;semi invivo降解实验发现相对于野生型,35S-SDIR1的植物提取液能够加速GST-ECA1通过26S蛋白酶体介导的降解过程。通过在烟草细胞中瞬时表达GFP-SDIR1融合蛋白和ER定位标记蛋白发现SDIR1可能定位于ER膜系统,瞬时共表达ECA1-GFP和RFP-SDIR1也发现这两个蛋白在植物叶片的表皮细胞中的共定位。另外,烟草瞬时表达也发现ECA1在保卫细胞中表达,而且当气孔关闭时ECA1-GFP的荧光与保卫细胞的叶绿体荧光重合,而SDIR1在保卫细胞中则没有被检测到。ECA1与SDIR1的共定位还需要在其它含有叶绿体的细胞中进一步确定。
通过对野生型、ECA1基因过表达植株以及其T-DNA插入突变体eca1-1和eca1-2比较研究发现,它们对植物激素和逆境胁迫的应答有所不同。与SDIR1过表达植物相似,eca1突变体植物对ABA和盐胁迫敏感,表现为种子萌发后生长受到抑制;但该突变体耐干旱能力提高,而ECA1过表达植物与sdir1-1一样,对干旱胁迫更为敏感,其主要因为是该植物叶片的气孔运动对ABA的敏感性提高。高浓度的Ca2+也促进eca1突变体和SDIR1过表达植物叶片气孔的关闭,同时低浓度和高浓度的Ca2+对eca1突变体植物和SDIR1过表达植物生长的抑制更为明显,说明ECA1和SDIR1参与细胞中的Ca2+信号。另外,eca1突变体和SDIR1过表达植物对内质网胁迫诱导剂衣霉素不敏感,在内质网胁迫条件下,这两种植物中内质网胁迫响应蛋白的蛋白量快速增加。通过对ECA1和SDIR1复合体的生物化学、细胞生物学和遗传学的研究发现其在ABA信号传导中可能是通过调控细胞中Ca2+的变化来实现。进一步的功能分析有助于研究ABA,Ca2+与内质网三者之间的联系及其信号传导机制。
本论文通过分子生物学,细胞生物学和遗传学的实验证明,ECA1可能是SDIR1的底物,并且ECA1和SDIR1通过调节细胞内Ca2+的变化参与ABA介导的植物抗逆反应。