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腈水合酶（Nitrile hydratase,简称NHase;EC:4.2.1.84）是一类催化腈类物质水合生成酰胺类产物的金属酶。酰胺类化合物作为化工原料或医药中间体被广泛应用,由于腈水合酶主导的生物催化法具有操作简单,催化效率高并且无副产物等优点,生物合成法已经取代化学合成法成为工业上生产酰胺类化合物的主要方法。但是大多数工业用腈水合酶酶活较低并且热稳定性不高,这极大限制了腈水合酶在工业上的进一步应用。基于此,本研究对嗜热假诺卡氏菌（Pseudonocardia thermophila JCM3095）来源的腈水合酶（PtNHase）进行分子改造,提升其催化性能。主要研究结果如下:（1）基于半理性设计提高PtNHase酶活。将位于PtNHase底物结合口袋的部分氨基酸残基进行突变,成功筛选到酶活显著提高的突变体M46K,其对于烟腈的比酶活为野生型腈水合酶的5.8倍;通过序列比对筛选到突变体F168Y,该突变体对于烟腈的比酶活为野生型腈水合酶的2.2倍;构建组合突变体M46K-F168Y,进一步将PtNHase对于烟腈的比酶活提高到574.0±17.5 U·mg-1,为野生型腈水合酶的7.5倍。（2）基于理性设计提高PtNHase的热稳定性。以Pt NHase为出发蛋白,通过在线热稳定性组合突变体设计工具Fireprot的辅助,成功获得热稳定性显著提高的组合突变体M10,其在62℃下的半衰期为150分钟,为野生型腈水合酶的7.6倍,酶活也由野生型腈水合酶的77.1±1.8 U·mg-1提高至168.8±5.3 U·mg-1。（3）基于上述获得的优势突变体,为进一步提高PtNHase的催化性能,构建组合突变体M46K-F168Y-M10。该突变体的热稳定性及酶活相对于野生型腈水合酶均有显著提高。组合突变体在62℃下的半衰期为100分钟,为野生型腈水合酶的5.1倍;比酶活为305.4±3.2 U·mg-1,为野生型腈水合酶的4.0倍;同时,突变体的产物耐受性较野生型腈水合酶提高15%。