论文部分内容阅读
目的:探讨lnc RNA GAS5对mi R-135b-5p的调节作用及其在宫颈癌Hela细胞EMT和迁移过程中的作用。方法:(1)Lnc RNA GAS5影响宫颈癌Hela细胞EMT的发生及迁移能力的实验研究:实时定量q RT-PCR技术分析Lnc RNA GAS5在人永生化表皮细胞Hacat和宫颈癌Hela细胞中的表达差异;构建pc DNA3.1 GAS5真核表达质粒,Western Blot和q RT-PCR检测EMT相关蛋白E-cad、N-cad、vimentin表达水平的改变;Transwell技术检测Lnc RNA GAS5高表达对Hela细胞迁移能力的影响。(2)Lnc RNA GAS5通过调控mi R-135b-5p的表达影响宫颈癌Hela细胞EMT的改变:Star Base v2.0数据库查找与Lnc RNA GAS5相关的mi RNA,生物信息学聚类分析与EMT及迁移密切相关的mi RNA,筛选得到mi R-135b-5p;q RT-PCR检测pc DNA3.1 GAS5转染后mi R-135b-5p的表达水平,荧光素酶报告系统检测pc DNA3.1 GAS5对mi R-135b-5p的调控。分别转染mi R-135b-5p mimic或mi R-135b-5p NC至Hela细胞中,Western Blot和q RT-PCR检测分析EMT相关蛋白E-cad、N-cad、vimentin表达水平的改变;Transwell技术检测mi R-135b-5p对Hela细胞迁移能力的影响;Lnc RNA GAS5和mi R-135b-5p共转染Hela细胞,Western Blot检测Lnc RNA GAS5对mi R-135b-5p促进Hela细胞EMT的逆转作用。(3)筛选mi R-135b-5p的相关下游靶基因:检索mi R-135b-5p成熟序列数据库(Target Scan、mi RDB、Mirtarbase),下载其全部靶基因,选择与EMT最为相关的基因作为后续的研究对象,荧光素酶报告基因确定mi R-135b-5p对靶基因的调控作用,Western Blot和q RT-PCR验证Lnc RNA GAS5/mi R-135b-5p/下游靶基因调控通路。结果:(1)Hela中的Lnc RNA GAS5的表达水平显著低于Hacat细胞,与对照组相比,当Lnc RNA GAS5上调时,E-cad的m RNA水平和蛋白水平显著增高、而N-cad和Vimentin显著降低。Transwell结果显示与对照组相比,过表达Lnc RNA GAS5后Hela细胞的迁移能力明显降低。(2)成功筛选出受Lnc RNA GAS5调控的mi RNA—mi R-135b-5p,Lnc RNA GAS5高表达可显著下调mi R-135b-5p的表达,野生型mi R-135b-5p荧光素酶报告基因的荧光素酶活性明显低于对照组,而突变型荧光素报告基因的荧光素酶活性与对照组相比无明显变化。(3)与对照组相比,mi R-135b-5p高表达时EMT相关蛋白E-cad的m RNA水平和蛋白水平显著降低,而N-cad和Vimentin显著增高。Lnc RNA GAS5可以部分逆转mi R-135b-5p的促EMT作用;(4)成功筛选出mi R-135b-5p下游靶基因—LATS2和KLF4,高表达mi R-135b-5p时,KLF4显著下调,而LATS2部分上调。Lnc RNA GAS5高表达时,KLF4的表达水平下调。结论:Lnc RNA GAS5可以抑制宫颈癌Hela细胞EMT的发生发展,降低其迁移能力。Lnc RNA GAS5抑制mi R-135b-5p并进一步使其下游靶基因KLF4的表达上调是其的调节机制之一。