抗肿瘤效应B细胞通过Fas/FasL途径直接杀伤肿瘤细胞且受IL-10和IL-2调控

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第一部分IL-10调控4T1TDLN B细胞的抗肿瘤效应目的:调控B细胞(Bregs)是一种调控免疫功能的B细胞,在肿瘤免疫中通过其分泌的IL-10来抑制机体的抗肿瘤功能。为了确定IL-10+TDLN B细胞或IL-10在WT4T1TDLN B细胞抑制4T1肿瘤细胞生长转移中的作用,我们检测IL-104-和WT4T1TDLN B细胞表达IL-10的情况,还比较了它们在体内和体外的抗肿瘤作用,以及IL-10抗体对WT4T1TDLN B细胞抗肿瘤效应的影响。方法:为了获得TDLNs,在4T1自发性乳腺癌肺转移肿瘤模型中我们将1×1064T1肿瘤细胞(在O.1ml的PBS中)皮下接种到同源的WT和IL-10-/-BALB/c小鼠侧腹下部靠近腹股沟的地方。4T1肿瘤细胞接种9天后,处死小鼠,无菌条件下收集TDLNs。小鼠LNs则直接取至正常BALB/c小鼠。然后通过CD19+微磁珠纯化分选得到TDLN B细胞和正常LN B细胞,再用抗CD40(2μg/m1)和LPS(5μg/ml)体外激活扩增B细胞3-4天,此时的TDLN B细胞为效应细胞。我们对激活之前和之后的TDLN B细胞、正常LN B细胞进行表型功能分析,激活之后的WT和IL-10-/-TDLNB细胞可以用来进行过继性免疫治疗研究和体外细胞毒性检测。为了获得4T1荷瘤小鼠,我们将5x1044T1肿瘤细胞皮下接种到正常小鼠的乳腺脂肪垫中,诱导生成自发性肺转移肿瘤小鼠。14天后,通过尾静脉输入3或15×106效应WT和IL-10-/-TDLN B细胞对这些荷瘤小鼠进行治疗,或是输入107效应WT TDLN B细胞和IL-10抗体。28-29天后,处死所有的荷瘤小鼠并收集其肺和计算肺转移结节数,还要收集脾和外周血,并检测每组小鼠的脾T、B细胞,PBMCs T、B细胞在体外的细胞毒性作用。结果:我们比较了纯化于WT和IL-10-/-4T1TDLNs以及正常LNs中的CD19+B细胞,细胞流式检测确定CD19+和CD19+IL-10+B细胞群,结果显示磁珠分选后的CD19+B细胞纯度大于95%,且纯化后的WT B细胞中有2-3%的细胞是CD19+IL-10+,而正如我们所预料的那样在IL-10-/-B细胞中几乎没有IL-10+细胞存在。在体外用LPS和抗CD40激活扩增培养后,WT B细胞中CD19+IL-10+的细胞增加到了11%左右,但在IL-10-/-B细胞中仍然没有CD19+IL-10+的细胞存在。另外,在激活扩增之前和之后的正常淋巴结B细胞中,也几乎不含有CD19+IL-10+细胞。我们还对比了WT4T1TDLN B细胞和IL-10-/-4T1TDLN B细胞的免疫治疗效果。和PBS空白对照组相比,仅IL-2或低剂量(3×106/mouse) WT4T1TDLN B细胞治疗并不能显著性地减少肺转移结节;高剂量(15×106/mouse)过继性输入WT4T1TDLN B细胞能显著性地抑制4T1肿瘤转移到肺上(p<0.05)。而且高剂量(15×106/mouse) WT4T1TDLN B细胞和高剂量(15×106/mouse) IL-10-/-4T1TDLN B细胞的抗肿瘤效果是相似的(p>0.05)。但是,与低剂量(3×106/mouse) WT4T1TDLN B细胞相比较,过继性输入低剂量(3×106/mouse) IL-10-/-TDLN B细胞能显著性地减少肺转移结节(p<0.05)。在体外,IL-10-/-4T1TDLN B细胞或WT4T1TDLN B细胞都不能显著性地杀伤Renca和TSA,但是WT4T1TDLN B细胞以剂量依赖性的方式杀伤4T1肿瘤细胞。在效应细胞和靶细胞的比例为10:1和30:1时,WT4T1TDLN B细胞和IL-10-/-4T1TDLN B细胞分别杀伤4T1的效率是没有显著性区别的;但在比例为3:1时,IL-10-/-4T1TDLNB细胞比WT4T1TDLN B细胞杀伤4T1肿瘤细胞的效率更高(p<0.05)。而在4T1乳腺癌自发性肺转移肿瘤模型中,我们用IL-10抗体和WT4T1TDLN B细胞过继性输入治疗荷瘤小鼠,结果表明与单效应WT TDLN B细胞或效应WT TDLN B细胞加上IgG/IgG1相比,IL-10抗体和效应WT TDLN B细胞能显著性地减少乳腺癌的肺转移(p<0.01)。收集各组小鼠脾和外周血,比较其T和B细胞的细胞毒性作用,结果显示:来源于WT4T1TDLN B细胞和IL-10抗体治疗组的PBMCs T细胞和B细胞,它们比其它各对照组的T细胞和B细胞更能显著性地杀伤4T1肿瘤细胞(p<0.05);来源于WT4T1TDLN B细胞和IL-10抗体治疗组的脾T细胞和B细胞,它们也比其它各对照组的T细胞和B细胞更能显著性地杀伤4T1肿瘤细胞(p<0.05)。结论:在本研究中,我们发现在WT4T1TDLN B细胞、IL-10-/-4T1TDLN B细胞和正常LN B细胞中,只有WT B细胞在激活和扩增之后都含有IL-10+的B细胞。在体外,TDLN B细胞能以肿瘤特异性的方式直接杀伤肿瘤细胞,且IL-10-/-4T1TDLN B细胞具有更高的直接杀伤肿瘤细胞效率:在体内以单个细胞为单位时,IL-10-/-4T1TDLN B细胞比WT4T1TDLN B细胞具有更高的抗肿瘤免疫效率。用IL-10抗体去除体内的IL-10可增强免疫系统的抗肿瘤功能,从而提高效应WT TDLN B细胞对肿瘤细胞的生长转移抑制作用。所以,在过继性免疫治疗中WT TDLN B细胞中的Bregs所生成的IL-10降低其抗肿瘤效应。第二部分4T1TDLN B细胞通过Fas/FasL途径直接杀伤4T1肿瘤细胞且IL-2调控其在体内的抗肿瘤效应目的:根据前期研究成果,我们已经证明效应TDLN B细胞过继性输入能抑制肿瘤细胞的生长转移,但其介导肿瘤细胞死亡的机制仍然不是很清楚。为了探讨效应TDLN B细胞介导肿瘤细胞死亡的可能机制,我们检测了TDLN B细胞表达FasL和IL-2R的情况以及FasL和IL-2的作用。方法:在4T1自发性肺转移肿瘤模型中,为了获得TDLNs我们将4T1肿瘤细胞皮下接种到同源的WT和IL-10-/-BALB/c小鼠侧腹下部靠近腹股沟的地方。4T1肿瘤细胞接种9天后,处死小鼠无菌条件下收集TDLNs。然后通过CD19+微磁珠分离纯化得到TDLN B细胞,再用CD40抗体和LPS体外激活扩增B细胞3-4天,此时的B细胞为效应细胞。我们检测了4T1肿瘤细胞Fas的表达情况和就体外LDH释放来评估Ant-FasL对效应B细胞细胞毒性的作用。激活之前和之后的TDLN B细胞可以用来进行表型功能分析。小鼠荷瘤14大后,对这些荷瘤小鼠进行治疗,即尾静脉输入107个效应TDLN B细胞,同时加入或不加入IL-2。28-29天后,处死所有的荷瘤小鼠并收集其肺和计算肺转移结节。结果:为了确定4T1TDLN B细胞直接杀伤4T1肿瘤细胞是否含有Fas/FasL途径,我们通过检测LDH释放来评估4T1TDLN B细胞对4T1肿瘤细胞的细胞毒性作用,另外还同时用anti-FasL阻断FasL。结果显示,4T1TDLN B细胞和4T1肿瘤细胞共培养8-12小时后,在E:T的比例为10:1和30:1时,与10μg/ml anti-FasL抗体相比,310μg/ml anti-FasL抗体能显著性地降低4T1TDLN B细胞的杀伤效率。流式检测IL-10-/-和WT4T1TDLN B细胞的FasL表达情况,结果表明anti-CD40/LPS激活培养WT4T1TDLNB细胞后,有大约5%细胞表达FasL,而表达FasL的IL-10-/-4T1TDLN B细胞为8%左右。WT4T1TDLN B细胞分别以10:1和30:1与4T1细胞培养12h后,表达FasL的B细胞从5.1%分别增加到13.5%和18.0%; IL-10-/-TDLN B细胞则分别增加到16.2%和14.3%。检测Fas在4T1肿瘤细胞上的表达时,结果发现几乎所有的4T1肿瘤细胞都表达Fas。另外,为了探讨IL-2在效应B细胞过继性免疫治疗肿瘤中的作用,我们比较了WT4T1TDLN B细胞或WT4T1TDLN B细胞+IL-2对肿瘤的治疗效果。结果显示WT4T1TDLN B细胞并不能抑制肿瘤转移,但是WT4T1TDLN B细胞和IL-2治疗能显著性地抑制了4T1肿瘤细胞从乳腺脂肪垫中转移到肺上(p<0.01);与无治疗组相比,仅IL-2并不能显著性地减少肺转移灶(p>0.05)。单IL-2或单4T1TDLN B细胞都没有体内抗肿瘤功能,只有两者结合起来才能抑制肿瘤生长转移。因此,我们检测了4T1TDLN B细胞IL-2R(CD25)的表达,激活之前WT和IL-10-/-4T1TDLN B细胞都有大约10%的细胞IL-2R+;体外激活扩增后,WT和IL-10-/-4T1TDLN B细胞中IL-2R+的细胞又都增加了,分别提高到16.7%和17.9%。结论:通过研究我们发现,IL-104-和WT4T1TDLN B细胞都表达FasL且并没有太大区别,和4T1细胞共培养后,表达FasL的B细胞都明显地增加,4T1肿瘤细胞表达Fas。所以4T1TDLN B细胞表面的FasL能与4T1肿瘤细胞表面的Fas结合并诱导4T1死亡,所以TDLN B细胞通过Fas/FasL途径杀死肿瘤细胞;它们还表达IL-2受体(IL-2receptor, IL-2R/CD25),且IL-2是效应TDLN B细胞在体内抑制肿瘤生长转移的必要条件。IL-2可能是直接调控作用于TDLN B细胞。这些结果说明了效应TDLN B细胞在过继性免疫治疗中的机制包含了Fas/FasL途径和IL-2调控。第三部分过继性输入B细胞的体内追踪研究目的:我们已经证实了效应(?)DLN B细胞可以分泌IL-10,抑制其抗肿瘤效应,B细胞还通过Fas/FasL途径介导肿瘤细胞死亡,且B细胞表达IL-2R、IL-2使效应TDLNB细胞具有在体内抗肿瘤的功能。但是,效应TDLN B细胞在过继性输入后,在体内迁移定位我们仍是不清楚。为了确定效应TDLN B细胞在体内的迁移定位,在效应TDLN B细胞过继性输入前被标记以便于我们对B细胞进行体内的追踪定位。方法:为了获得TDLNs,我们将4T1肿瘤细胞接种到WT BALB/c小鼠侧腹下部靠近腹股沟的地方,4T1肿瘤细胞接种9天后,处死小鼠无菌条件下收集TDLNs。然后通过CD19+微磁珠纯化分离得到TDLN B细胞,再用CD40抗体和LPS体外激活扩增B细胞3-4天,此时的B效应细胞再被10μM CMTMR37℃避光孵育45min。荷瘤小鼠4T1肿瘤细胞接种14天后,通过尾静脉对这些荷瘤小鼠或正常小鼠输入标记的TDLN B细胞,分别在过继性输入后第1、5、9和14天时,处死荷瘤小鼠和正常小鼠并收集其肿瘤、肺、脾和TDLN是,流式检测这些组织器官中的标记TDLN B细胞和计算其数目。结果:为了了解效应TDLNB细胞在体内的定位,CMTMR标记TDLN B细胞后进行其体内追踪。在输入前结果表明CMTMR100%标记效应TDLN B细胞。在过继性治疗第1、5、9、14天时,流式检测这小鼠的TDLNs、脾、肺和肿瘤中活的标记CD19+B细胞。结果显示过继性输入B细胞在第9天时,乳腺脂肪垫肿瘤和肺中所有CD19+B细胞中所占的比例明显较高。而且在第14天能明显观察到肿瘤肺转移时,输入的B细胞在肿瘤和肺总B细胞中仍占较高比例,而过继性输入B细胞在TDLN和脾中所占比例一直都比较低。另外,与在荷瘤小鼠肺中输入的B细胞相比,在正常小鼠肺中只有很低比例的TDLN B细胞。根据流式结果计算4种组织器官中过继性B细胞的实际数目,虽然过继性B细胞在脾和TDLN的总B细胞中所占百分比较低,但是其实际数目却比肿瘤和肺中的明显要多一些(p>0.05)。结论:这些结果证明过继性B细胞并不是优先迁移到肿瘤的,但是过继性B细胞比内源性B细胞更易于迁移到肺和肿瘤中。过继性TDLN B细胞可能直接作用于原发性肿瘤和转移性肿瘤细胞来抑制肿瘤细胞的肺转移,TDLN B细胞在体内的全身定位和存活依赖于其和肿瘤细胞的相互作用。
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