目的:　　通过转瓶将PC-3细胞大量扩增，扩增得到的细胞转入2L WAVE生物反应器中进行大规模微载体悬浮培养。通过胰酶消化及细胞再次贴壁微载体在生物反应器中实现微载体上细胞球转球扩大培养。建立起一整套从转瓶贴壁培养到生物反应器中微载体悬浮培养的细胞培养体系。为前列腺癌疫苗的大规模生产提供技术支持。　　方法:　　1.转瓶中贴壁培养PC-3细胞条件优化。　　在850cm2转瓶中贴壁培养PC-3细胞，扩增细胞数量，从而培养出足够数量的细胞并在WAVE生物反应器上进行大规模微载体悬浮培养。摸索转瓶中贴壁培养的细胞接种密度，通过计数未贴壁的细胞密度来计算细胞在不同转速下的贴壁率，从而得出在转瓶贴壁培养过程中转速对于细胞贴壁及后续生长传代的影响。实现细胞在转瓶中扩大培养。　　2.小规模微载体静止培养PC-3细胞条件优化。　　在细菌培养皿中分别接种3×105cells/mL、5×105cells/mL及7×105cells/mL的细胞密度，加入过量的微载体供细胞贴壁。每24h监测葡萄糖浓度及细胞密度，根据葡萄糖代谢曲线及细胞生长速度，探索最适的细胞接种密度及在该密度下细胞培养模式、换液方式。在最佳细胞接种密度的基础上选择2g/L、3g/L、4g/L及5g/L的微载体浓度做对比实验，从细胞增长情况对比判断最佳微载体浓度。对比细胞在微载体上不经胰酶消化直接加入新的微载体，通过细胞间的“桥联”作用实现微载体上细胞球转球扩大培养与消化10min、15min、20min、及30min后再加入新的微载体使细胞重新贴壁的球转球扩大培养效果。经两种放大培养方式处理后再培养四天，对比细胞生长速度及最后收获的细胞数量，最终确定最佳的培养方案。为WAVE生物反应器上大规模培养提供参考。　　3.WAVE生物反应器上大规模悬浮微载体培养PC-3细胞条件优化。　　在WAVE生物反应器400mL培养体积条件下，以5×105cells/mL的初始细胞接种密度为基础再一次探索3g/L、4g/L及5g/L微载体浓度对细胞生长的影响，每24h对细胞进行抽样，观察细胞生长情况、检测葡萄糖浓度，计数细胞并绘制细胞密度曲线。同时根据小规模培养时的消化结果，在WAVE生物反应器中对细胞消化15及20min并加入新的微载体继续培养，观察不同的消化时间对于细胞后续贴壁及生长传代的影响，并与不消化直接加微载体进行细胞球转球扩大培养方式做对比，从而选择最佳的细胞球转球扩大培养方案，为大规模制备前列腺癌肿瘤疫苗奠定基础。将培养结束后收获的细胞固定，锚定GM-CSF与TNF-a两种蛋白制备成肿瘤疫苗并检测疫苗的锚定率。　　结果:　　1.建立起转瓶培养PC-3细胞的新方法，筛选出2×105cells/mL为最佳起始接种密度（在200mL的培养体积中细胞起始接种数量为4×107cells），并确立在转瓶中连续培养4天的贴壁培养方式。探索出细胞贴壁的最佳起始转速为4rph，根据先慢后快的贴壁细胞转瓶培养模式[1]，在培养的第三天将转瓶的转速调整为6rph取得了良好的效果，培养四天后单个转瓶的细胞数量最高可达8-10×107cells。　　2.在小规模微载体静止培养条件下，根据葡萄糖浓度和细胞密度变化曲线，将5×105cells/mL作为细胞初始接种密度。同时根据不同微载体浓度对细胞生长的对比结果，选择3g/L或4g/L作为最适微载体浓度。通过对不消化直接加入新载体与消化不同时间后再加入新微载体两种细胞球转球扩大培养方式的对比，最终确定在胰酶消化15或20min后再加入微载体更有利于细胞后续生长。　　3.在WAVE生物反应器中，通过5度、8rpm摆动2min，静止培养20min的循环培养模式进行微载体悬浮培养细胞。在5×105cells/mL起始细胞接种密度条件下，选择3g/L的微载体浓度做为最适浓度。根据WAVE生物反应器中胰酶消化后微载体球转球扩大培养结果，最终选择经胰酶消化20min做为最佳消化时间，从而实现细胞在WAVE生物反应器中微载体球转球扩大培养。最终在2L生物反应器中细胞密度达到1.3×106cells/mL，细胞总量可达109个数量级。　　结论:　　在小规模微载体静止培养PC-3细胞实验结果的基础上利用转瓶将细胞数量扩增，并在WAVE生物反应器中对培养条件再次进行优化，最终建立起一整套PC-3细胞培养方案，同时掌握了在WAVE生物反应器中微载体悬浮培养细胞胰酶消化球转球扩大培养技术，为大规模制备前列腺癌疫苗提供技术储备。