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目的:顺铂(Cisplatin,DDP)是一种高效广谱的抗癌药,其疗效呈剂量相关性,但大剂量可以引起不可逆性肾功能损害及严重的胃肠道反应,从而限制了临床应用及疗效的进一步提高。热疗(Hyperthermia)除了能够直接杀伤癌细胞外,还具有化疗增敏作用,两者结合可以显著提高抗肿瘤效果。本研究通过体外试验探讨热疗联合顺铂对胃癌MGC-803细胞增殖抑制作用,并对可能存在的机制进行初步的探讨,从而为热疗在临床上的应用提供了有力的依据。方法:1体外培养人胃癌细胞株MGC-803,应用四甲基偶氮唑蓝(tetrzolium-based colorimetric assay,MTT)法测定不同的顺铂浓度组(0.625、1.25、2.5、5、10、20μg/mL)细胞的增殖抑制率,确定顺铂的工作浓度,并以该浓度进行实验。2 MTT法测定对照组和低、中、高顺铂浓度组(1.5、7、12μg /mL)及其对应的热化疗组细胞的存活率,根据Weeb系数判断热化疗联合是否有协同效应。3随机分为四个实验组:对照组、热疗组、化疗(DDP)组、热化疗组,选择顺铂培养24h后、细胞生长抑制率达30%的药物浓度作为实验的工作浓度。流式细胞仪(flow cytometry,FCM)检测各组处理后细胞周期的分布。4分别提取各组细胞总RNA,鉴定其完整性及含量,通过逆转录-聚合酶链反应(revers transcription PCR,RT-PCR)半定量检测不同因素处理后胃癌MGC-803细胞中细胞周期蛋白D1(CyclinD1)mRNA、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)mRNA的表达水平。5采用流式细胞术检测各组处理后胃癌MGC-803细胞中CyclinD1、PCNA蛋白的表达变化。结果:1 MTT结果显示:在一定的浓度范围内,不同浓度的DDP对MGC- 803细胞作用24小时后,其剂量-效应呈线性相关,线性相关分析抑制率与药物浓度呈正相关( r=0.8551,P=0.0300),直线回归分析求出DDP浓度( x)与抑制率( y)的回归方程y=0.1801+0.0444x,选择培养24h后、细胞生长抑制率达30%的药物浓度作为实验的工作浓度,计算DDP的实验为2.7μg/ml。2 MTT结果显示:随着顺铂浓度的升高,化疗组及热化疗组细胞存活率逐渐降低,且热化疗组细胞存活率与化疗组细胞存活率相比显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。采用Weeb系数分别判定热化疗联合的相互作用,Weeb分析的结果表明低、中、高浓度的DDP分别联合热疗对MGC-803细胞的增殖抑制作用具有协同效应。3流式细胞仪检测胃癌MGC-803细胞周期分布显示,热疗组:与对照组相比,G0/G1期细胞比例显著升高,S期细胞比例显著降低,差异有统计学意义( P<0.05)。化疗组:与对照组相比,S期比例显著降低,G0/G1期、G2/M期细胞比例显著升高,差异有统计学意义( P<0.05)。热化疗组:与其它三组相比,S期细胞比例显著降低,G0/G1期细胞比例显著升高,差异有统计学意义( P<0.05)。4 RT-PCR检测结果显示:CyclinD1:与对照组相比,热疗组、化疗组及热化疗组联合均可使CyclinD1mRNA表达量显著降低,差异有统计学意义(P<0.05),热化疗组与热疗组或化疗组相比,CyclinD1mRNA表达量显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。PCNA:热疗组、化疗组、热化疗组和对照组比较,均可使PCNAmRNA表达量显著降低,差异有统计学意义(P<0.05),热化疗组与热疗组或化疗组相比,PCNAmRNA表达量显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。5流式细胞术检测CyclinD1、PCNA蛋白表达水平结果显示:CyclinD1蛋白:与对照组相比,热疗组、化疗组及热化疗组联合均可使CyclinD1蛋白表达量显著降低,差异有统计学意义(P<0.05),热化疗组与热疗组或化疗组相比,CyclinD1蛋白表达显著降低,差异有统计学意义( P<0.05)。PCNA蛋白:热疗组、化疗组、热化疗组和对照组比较,均可使PCNA蛋白表达量显著降低,差异有统计学意义(P<0.05),热化疗组与热疗组或化疗组相比,PCNA蛋白表达量显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:1低、中、高浓度的DDP分别联合热疗对MGC-803细胞的增殖抑制作用具有协同效应。2热化疗联合使细胞周期的分布发生改变,减少了增殖细胞在S期的分布,阻断细胞在S期的DNA合成,影响了细胞周期的正常运行,使细胞生长变慢,甚至凋亡。3热化疗联合能够在基因水平和蛋白水平显著下调CyclinD1和PCNA的表达;推测细胞周期相关蛋白的改变进而引起细胞周期阻滞可能是热化疗抑制MGC-803细胞增殖的机制之一。4本实验证实热疗协同顺铂对体外胃癌MGC-803细胞有显著的增殖抑制作用,从而为临床上热化疗的协同应用以提高抗肿瘤作用提供了体外实验参考依据。