肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae,MP）感染患者后引起肺炎支原体肺炎（Mycoplasma pneumoniae pneumonia,MPP）,MPP也是社区获得性肺炎（community acquired pneumonia,CAP）,因此MP也是引起CAP的一种病原体。MP的感染遍布全球,通常爆发于社团,尤其对老人及儿童危害严重,但至今仍无有效疫苗。MP的一端带有的粘附器具有重要作用,可使MP定居于宿主细胞的外表,然后与宿主细胞发生融合,最后溶解细胞引起宿主细胞的死亡。粘附器中的黏附素,即P1蛋白,除了可以粘附宿主细胞外,还是一种较为重要的免疫原。因此,近年来针对P1蛋白作为主要免疫原的亚单位疫苗成为研究的热点。目前国内外已有多篇文献报道了基因组中携带外源基因的甲型流感病毒（Influenza A virus,IAV）,随着IAV的生长增殖而表达外源蛋白。IAV载体有多种优点:IAV载体的基因组中可以插入多种外源基因;可以诱导机体产生特异性免疫;安全性较高;可作为二价疫苗使用;IAV在鸡胚或细胞培养方面有广泛的经验。A/Puerto Rico/8/34（PR8）毒株为甲型流感病毒H1N1。该甲型流感病毒为人流感病毒高产病毒株,也是鸡胚适应株,常作为生产流感疫苗的骨架。本研究中,我们首先构建了携带肺炎支原体P1蛋白基因的NS基因节段的重组质粒（命名为NS-P1）,在293T细胞中共转染PR8病毒株的PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M等7个正常质粒和NS-P1重组质粒,即通过反向遗传学技术拯救出携带肺炎支原体P1基因的重组病毒（命名为PR8-NS-P1）,血凝实验发现PR8-NS-P1的血凝效价为1:128。提取其RAN,经鉴定发现PR8-NS-P1中含有P1蛋白基因,测序结果显示基因序列完全符合。PR8-NS-P1在鸡胚中扩大培养后进行纯化除卵清蛋白,然后免疫新西兰大白兔和Balb/c小白鼠。实验动物免疫后,观察其体重变化和外观特征,发现大白兔的体重在一周内逐渐增高,外观无任何变化。滴鼻免疫原液组小白鼠一周内体重出现明显下降,肌注组小鼠体重升高;106EID50滴鼻组小鼠体重基本维持不变,其余组小鼠体重均升高。体重下降的小鼠出现炸毛、蜷缩、行动迟缓等症状,其余小鼠无明显变化。采集实验动物第一次免疫和第二次免疫的血清,利用ELISA实验检测血清中是否含有MP的特异性抗体,结果显示小白鼠的血清OD值最高超过2.0,而大白兔血清OD值约为1.0左右,但是与阴性对照组相比均有显著性差异。利用免疫兔血清进行生长抑制试验检测血清中MP特异性抗体的滴度,结果显示空白对照组的抗体滴度为0,而实验组为1:8。此外,血清与MP在固体平板培养基中的共培养结果也显示,实验组血清可以显著抑制MP增殖。然后通过MTT实验检测免疫兔血清对MP感染体外细胞模型A549细胞的作用,结果显示免疫兔血清可以显著抑制MP感染A549细胞。接下来给予二次免疫的小白鼠进行了MP挑战实验,实验组和对照组的小白鼠一半接受低剂量的MP挑战实验（106CCU/ml）,另一半接受高剂量的MP挑战实验（108CCU/ml）。4天后解剖小鼠取其肺组织,其肺组织MP载量检测结果发现,免疫病毒原液的小白鼠在接受高剂量MP挑战实验后,其肺组织MP载量均较低;低剂量MP挑战实验后,小鼠肺组织MP的清除率较高,而且滴鼻组约为96%,高于肌注组。免疫106EID50病毒的小鼠,滴鼻组的肺组织MP载量均较低,肺组织清除率超过90%;但肌注组的MP载量较高,而清除率也较高为92%,这一点有些相互矛盾。免疫105EID50病毒的小鼠,滴鼻组和肌注组小鼠的肺组织MP载量都较高,肺组织的清除率为70%左右。综上所述,研究发现携带肺炎支原体P1基因的重组甲型流感病毒PR8-NS-P1免疫新西兰大白兔和Balb/c小白鼠后,可以引起实验动物体内的免疫反应,获得的血清中经检测含有MP特异性抗体。体外试验发现,血清显著抑制了MP的体外增殖,而且还可抑制MP对A549细胞的感染作用。小白鼠的MP挑战试验发现,PR8-NS-P1可以有效保护实验动物免受MP的感染。此课题为开发肺炎支原体肺炎的亚单位蛋白疫苗提供了一定的理论基础。