【摘 要】
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酱香是中国传统发酵风味之一深受人们青睐,迄今为止,枯草芽孢杆菌产酱香风味的机制还仍然不清。前期对Bacilus subtilis BJ3-2进行中温(45℃)和中低温(37℃)发酵,发现中温产酱香,中低温产豉香,通过转录组测序差异性和富集分析,筛选得到多个差异显著基因,通过对差异基因进行生物信息学分析,最终选择磷酸烯醇丙酮酸激酶(PCKA)和棉子糖、水苏糖、蜜二糖转运系统底物结合蛋白(MSME)作
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酱香是中国传统发酵风味之一深受人们青睐,迄今为止,枯草芽孢杆菌产酱香风味的机制还仍然不清。前期对Bacilus subtilis BJ3-2进行中温(45℃)和中低温(37℃)发酵,发现中温产酱香,中低温产豉香,通过转录组测序差异性和富集分析,筛选得到多个差异显著基因,通过对差异基因进行生物信息学分析,最终选择磷酸烯醇丙酮酸激酶(PCKA)和棉子糖、水苏糖、蜜二糖转运系统底物结合蛋白(MSME)作为候选基因,研究其对枯草芽孢杆菌产酱香方面功能的影响。主要研究内容及结果如下:1.通过生物信息学分析绘制候选基因pck A、msm E与酱香风味代谢相关的代谢通路,pck A参与三羧酸循环代谢途径,将草酰乙酸转化为磷酸烯醇丙酮酸,磷酸烯醇丙酮酸在丙酮酸激酶的作用下转化为丙酮酸,丙酮酸在酶的作用下生成乙偶姻,乙偶姻与铵反应生成酱香物质四甲基吡嗪。msm E参与低聚糖转运途径,控制细胞内外低聚糖的运输,低聚糖通过糖酵解途径分解为丙酮酸,丙酮酸在酶的作用下生成乙偶姻,进而与铵反应生成酱香物质四甲基吡嗪;2.选用16S r RNA作为内参基因,荧光定量PCR对Bacilus subtilis BJ3-2在37℃和45℃培养条件下候选基因pck A与msm E的表达量进行测定。结果显示:pck A与msm E在45℃的表达量分别为在37℃的0.57倍和1.38倍;3.构建pck A与msm E同源重组双交换敲除载体。以p UC18为初始载体,依次通过Eco R I、Sac I、Bam H I、Pst I将从BJ3-2基因组扩增的对应基因的左臂(HLarm)、右臂(HRarm)以及氯霉素乙酰转移酶基因(cat)连接,菌落PCR、质粒PCR、双酶切、测序验证,最终分别获得p UC18+HLarm+cat+HRarm同源重组敲除载体;4.将双交换敲除质粒载体转化至原始菌株枯草芽孢杆菌BJ3-2中,通过革兰氏染色、PCR验证、测序验证,最终成功筛选出BJ3-2△pck A与BJ3-2△msm E基因敲除菌株;5.利用BJ3-2△pck A与BJ3-2△msm E发酵豆豉,通过GC-MS对豆豉进行挥发性风味物质检测,并结合感官给予评价。BJ3-2△pck A发酵的豆豉相对BJ3-2发酵的豆豉而言,酱香味增加,发酵后豆豉之间存在大量粘丝;BJ3-2△msm E发酵的豆豉相对BJ3-2发酵的豆豉而言,豆豉呈现深褐色,质地粘稠豆豉间存在大量粘丝,酱香味减弱。GC-MS结果显示:相对于BJ3-2发酵的豆豉,BJ3-2△pck A发酵的豆豉中乙偶姻的含量从8.618%降到7.721%,四甲基吡嗪的含量从12.444%增到15.394%;同时BJ3-2△msm E发酵的豆豉中乙偶姻的含量从8.618%增到28.122%,四甲基吡嗪的含量从12.444%降到9.124%。最后将实验结果和pck A和msm E参与的代谢通路进行联合分析,认为pck A通过调控三羧酸循环中磷酸烯醇丙酮酸的生成,进而影响丙酮酸的代谢负调控酱香风味的生成;msm E通过调控细胞内外低聚糖的运输影响糖酵解途径中丙酮酸的生成正调控酱香风味的生成。研究通过GC-MS检测豆豉的挥发性风味物质发现,中高温可以使枯草芽孢杆菌BJ3-2产酱香;通过成功敲除pck A、msm E,发现pck A是酱香风味的负调控基因,通过调控三羧酸循环中磷酸烯醇丙酮酸的生成影响丙酮酸的代谢调控酱香风味;msm E是酱香风味的正调控基因,通过调控细胞内外低聚糖的转运影响糖酵解中丙酮酸的代谢调控酱香风味;敲除msm E后发酵的豆豉酱香减弱豆豉褐化程度加深,说明酱香与食物褐化程度不呈正相关。
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