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背景和目的:POI是指女性在40岁以前出现卵巢功能减退,主要表现为月经稀发或闭经、血清促性腺激素水平升高（FSH>25 U/L）、雌激素水平波动性下降。POI影响约1%小于40岁和0.1%小于30岁的女性,可诱发多种健康风险。大约有25%的POI是由医源性因素引起的,其中包括化疗。尽管化疗引起POI的机制尚未被完全阐明,但是化疗诱导的卵母细胞和颗粒细胞的凋亡目前被认为是主要机制,其导致了卵泡的闭锁和卵巢功能的丧失。POI目前尚没有有效的治疗方法。因此,探索、研究和改进POI的治疗策略具有重要意义。再生医学研究表明,MSCs移植可以部分恢复POI动物模型的卵巢功能和生育功能,虽然其疗效仍需进一步改善和促进,但这为临床治疗POI提供了一种可能的有效方法。h AD-MSCs具有较强的自我更新能力及多向分化潜能、低免疫原性、获取过程安全无创和无伦理争议等优势,这使其将来可能成为用于组织工程和再生医学的种子细胞。所以,本课题选用hAD-MSCs移植治疗大鼠化疗性POI并观察其疗效。超声波是机械振动能量的一种传播形式,当用超声波来辐照组织细胞且辐照的剂量超过一定阈值时,就会通过与组织细胞的某种相互作用机制对后者的状态、功能或（和）结构发生一定的影响,产生生物效应。LIPUS是一种脉冲式发射的超声波,其声强低,引起组织细胞单位体积时间内产生的热能低,可避免超声的热效应对组织细胞的损害。研究显示,LIPUS可促进细胞内各种生长因子和抗炎分子的表达和分泌,包括FGF2,IGF-1和VEGF,而这些细胞因子是卵巢组织中卵泡生长所必需的,而且还可以抑制和减少卵巢GCs凋亡。研究已证实MSCs具有对物理刺激感受和反应的能力。因此,将LIPUS作用于hAD-MSCs就有可能促进h AD-MSCs表达和分泌上述细胞生长因子,如果这一设想被证明成立,结合前面提及的化疗性POI的发生机制,那么,经LIPUS预处理后的h AD-MSCs移植是否可能更有利于化疗性POI的治疗呢?本课题旨在研究hAD-MSCs和LIPUS预处理后的hAD-MSCs移植治疗大鼠化疗性POI的疗效,并对相应作用机制进行初步探讨。方法:（1）从胎盘羊膜分离、提取和培养hAD-MSCs。通过显微镜下观察细胞形态特征、流式细胞仪检测细胞表型特点和多向诱导分化培养细胞以鉴定分离培养的原代细胞。（2）通过CCK-8法、流式细胞周期检测和EdU细胞增殖实验分析研究LIPUS对hAD-MSCs的细胞活性和增殖的影响,筛选出利于细胞活性及增殖的最适ISATA和ET。Western blot检测细胞周期蛋白的表达水平。采用RT-qPCR和ELISA法检测LIPUS对hAD-MSCs生长因子表达和分泌的作用。（3）动物实验部分,将160只1012周动情周期正常的健康SD雌鼠随机分为四组,即正常对照组,POI组,hAD-MSCs移植组（hAD-MSCs）和LIPUS预处理后的hAD-MSCs移植组（LIPUS+h AD-MSCs）,每组40只。首先,对POI组,hAD-MSCs组和LIPUS+hAD-MSCs组大鼠经腹腔注射CTX/0.9%NaCl溶液建立化疗性POI模型,首次CTX负荷剂量为50mg/kg,随后以8mg/（kg·d）的剂量再连续注射14d;同时,对正常对照组大鼠按照建模的方案经腹腔注射等量的0.9%NaCl。另外,将hAD-MSCs分为对照组和LIPUS组,分别给予细胞连续5天的假照射（LIPUS设备开关未开）或LIPUS(采用体外实验筛选出的最适ISATA和ET)处理,之后用PKH26标记细胞。建模结束后24 h,对h AD-MSCs组和LIPUS+hAD-MSCs组大鼠分别经尾静脉注射0.6 ml含4×106个假照射或LUPUS处理后的PKH26标记的hAD-MSCs的PBS细胞悬液;同时,对正常对照组和POI组大鼠分别注射0.6mL PBS液。于干细胞移植后24h、2周、4周、6周、8周和10周处死大鼠,采集相关实验材料,追踪hAD-MSCs在大鼠体内的分布及归巢情况,检测大鼠血清性激素水平,各级卵泡数目,卵巢病理改变,GCs凋亡,Bcl-2和Bax表达,以及促炎细胞因子水平等。（4）为了探讨hAD-MSCs和LIPUS预处理后的hAD-MSCs移植治疗大鼠化疗性POI的作用机制,我们将48只1012周动情周期正常的健康SD雌鼠随机分为四组,即正常对照组,POI组,LIPUS-CM组和Control-CM组,每组12只。首先,对POI组,LIPUS-CM组和Control-CM组大鼠建立化疗性POI模型。另外,将hAD-MSCs分为对照组和LIPUS组,分别给予细胞连续5天的假照射或LIPUS(采用体外实验筛选出的最适ISATA和ET)处理,之后收集细胞上清液,即Control-CM和LIPUS-CM。同时,取细胞培养基作为对照CM,即CF-CM。将三种CM进行10倍浓缩处理。建模结束后24 h,取浓缩后的CF-CM,CF-CM,LIPUS-CM和Control-CM分别局部注射到对应的正常对照组,POI组,LIPUS-CM组和Control-CM组大鼠的两侧卵巢组织中,每侧卵巢注射50μL。于CM注射后2周和4周处死大鼠,采集相关实验材料,进行大鼠血清性激素水平,卵巢病理改变,卵巢组织局部GCs凋亡和VEGF表达水平等检测。结果:（1）我们从羊膜组织中成功分离出hAD-MSCs,分离出的h AD-MSCs经鉴定具有间充质干细胞的特点。（2）LIPUS在体外可以增加hAD-MSCs的细胞活性并促进其增殖。流式细胞周期分析显示LIPUS可促进细胞从G0/G1期进入S期和G2/M期。Western blot结果显示LIPUS显著上调cyclin D1,cyclin E1,cyclin A2和cyclin B1的表达。在其它参数固定条件下,根据CCK-8法、流式细胞周期检测结果,ISATA=30mW/cm2和ET=30min被确定为利于细胞活性及增殖的最适LIPUS参数用于后续实验。LIPUS在ISATA=30mW/cm2和ET=30min参数条件下持续辐照处理hAD-MSCs 5天,其可以促进hAD-MSCs表达和分泌IGF-1,HGF和VEGF。（3）hAD-MSCs经尾静脉移植入POI大鼠体内后主要归巢到了卵巢组织,在卵巢组织内见大量的红色荧光信号。hAD-MSCs和LIPUS预处理后的hAD-MSCs移植均可以增加POI大鼠的体重和生殖器官重量,改善卵巢功能和减少生殖器官损伤。hAD-MSCs移植升高了卵巢组织Bcl-2/Bax比率,减少了卵巢中化疗诱导的GCs凋亡和卵巢局部炎症,而这些效用通过LIPUS预处理hAD-MSCs后得以增强。（4）hAD-MSCs和LIPUS预处理后的hAD-MSCs移植入POI大鼠体内后,PKH26标记的细胞仅位于卵巢组织间隙中,而未在卵泡中。在细胞移植后8周,hAD-MSCs和LIPUS预处理后的hAD-MSCs均未表达卵母细胞和颗粒细胞相关特异性抗原ZP3和FSHR,表明h AD-MSCs移植入大鼠卵巢组织内后未分化为卵母细胞、颗粒细胞或卵泡。（5）Control-CM和LIPUS-CM卵巢局部注射均可以部分改善化疗性POI大鼠的卵巢功能,减轻卵巢组织损伤和GCs凋亡,促进卵巢组织VEGF的表达,但两组比较没有显著性差异。结论:（1）LIPUS可促进hAD-MSCs的活性和增殖;LIPUS可以促进hAD-MSCs表达和分泌细胞生长因子。（2）hAD-MSCs和LIPUS预处理后的h AD-MSCs移植均能修复化疗引起的POI大鼠的卵巢损伤并改善卵巢功能。经LIPUS预处理后的hAD-MSCs移植更有利于减轻POI大鼠卵巢组织的炎症反应,改善局部微环境,并抑制化疗诱导的GCs凋亡。（3）Control-CM和LIPUS-CM卵巢局部注射可部分改善化疗性POI大鼠的卵巢功能及减轻卵巢损伤。（4）hAD-MSCs和LIPUS预处理后的h AD-MSCs移植治疗大鼠化疗性POI的作用机制可能是由h AD-MSCs通过旁分泌途径部分介导的。