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气单胞菌是危害水产动物的重要病原菌,不仅可引起水产养殖动物严重的败血性疾病,而且可以通过水产动物和水产品感染人畜,导致人畜腹泻和食物中毒,危害人类健康。安徽是水产养殖大省,养殖产量逐年递增,但是随着水产养殖业的迅速发展,各类病害频繁发生。近几年调查资料显示,我省水产养殖动物气单胞菌病发病率达 60%以上,死亡率超过 25%,严重制约了我省水产养殖业的健康发展。而我省对该病的研究相对不足,常常由于不能快速确定病原、及时制定有效的防治措施,导致气单胞菌病造成的损失不断出现。针对这一实际问题,本课题拟以 15 株疑似气单胞菌为研究对象,采用细菌数值鉴定法证实分离菌为不同表型种气单胞菌的基础上,建立了一种可同时用于气单胞菌病快速诊断和分子流行病学调查的多重 PCR 方法,并应用该方法检测安徽分离株携带毒力基因情况,探明我省气单胞菌的分子流行病学特征,为该病的快速诊断、监测和综合防治提供方法和科学依据。研究中同时对安徽分离株的三种主要毒力基因进行克隆与序列分析,旨在为全面了解该菌的分子生物学特性积累资料,为研制气单胞菌基因工程疫苗奠定基础。 首先,采用细菌数值鉴定法和动物实验对 15 株分离菌进行数值鉴定和致病性测定。研究中采用革兰氏阴性杆菌七位编码鉴定试剂盒对分离菌进行数值鉴定,结果显示 15 株分离菌均为气单胞菌,但表型种有所不同,其中 BA1、BA3、BA17、HA6、HA7 和 CA2 6 株细菌为嗜水气单胞菌（A.hydrophila）;BA11、BA16、JA23、JA24、CA1、CA3、GA1 和 HSA1 8 株细菌为温和气单胞菌（A.sobria）;BA18菌株为豚鼠气单胞菌（A.caviae）。动物实验结果显示 15 株气单胞菌安徽分离株中除 CA2 和 HSA1 二株细菌为非致病菌外,其余 13 株细菌均为致病性气单胞菌,但其毒力在不同表型种间和不同菌株间存在一定差异,其中 BA1、BA3、BA11、BA17、BA18、CA3、GA1、HA7、JA23 和 JA24 10 株气单胞菌对本种动物致死率均为 100%;HA6、CA1 和 BA16 3 株细菌的致死率分别为 66.7%、50%和 30%。 其次,建立用于气单胞菌病快速诊断和分子流行病学调查的 MPCR 方法。研究中以粘附素基因（aha1）、溶血素基因（hly）和肠毒素基因（alt）三种主要毒力基因的高度保守区设计合成特异性引物并通过优化反应条件,建立了 MPCR方法。该方法在 12h 内即可从病料中或分离菌中检测出一种或任何组合的气单胞菌毒力基因,其特异性强,敏感度达 102 cfu·mL-1。 再次,应用 MPCR 方法检测安徽分离株携带毒力基因情况,确定其分子流行病学特征。研究中分别提取细菌基因组 DNA 作为模板,进行 alt、hly 和 aha1