【摘 要】
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目的 构建带Flag标签的RING结构泛素连接酶26（Ring finger protein 26,RNF26）真核表达载体，表达Flag-RNF26的融合蛋白，通过细胞免疫荧光实验，观察其在人肝癌细胞HepG2中的定位及与带绿色荧光蛋白标签的死骨片1（sequestosome 1,SQSTM1）是否存在共定位。方法 以人乳腺文库为模板，应用PCR技术扩增出RNF26的编码区序列，双酶切后插入带F
【基金项目】
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国家自然科学基金面上项目(81672602；
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目的 构建带Flag标签的RING结构泛素连接酶26（Ring finger protein 26,RNF26）真核表达载体，表达Flag-RNF26的融合蛋白，通过细胞免疫荧光实验，观察其在人肝癌细胞HepG2中的定位及与带绿色荧光蛋白标签的死骨片1（sequestosome 1,SQSTM1）是否存在共定位。方法 以人乳腺文库为模板，应用PCR技术扩增出RNF26的编码区序列，双酶切后插入带Flag标签的pCMV-Tag2B载体中，构建pCMV-Tag2B-RNF26重组质粒；将测序正确的重组质粒和pCMV-Tag2B空载体分别转染人胚肾293T细胞中，Western印迹检测融合蛋白表达情况，将成功表达的质粒pCMV-Tag2B-RNF26与pEGFP-SQSTM1质粒转染至人肝癌细胞HepG2中，进行免疫荧光染色，荧光显微镜观察SQSTM1和RNF26的共定位情况。结果 插入片段的DNA序列测序结果与目的基因序列相同，Western印迹检测提示，融合蛋白成功表达；免疫荧光结果表明，RNF26与SQSTM1蛋白在细胞质中存在共定位。结论 pCMVTag2B-RNF26真核表达载体构建成功。带Flag标签的人RNF26蛋白在HepG2细胞内成功表达，且与SQSTM1蛋白存在共定位，为进一步研究RNF26和SQSTM1的相互作用关系建立了实验基础。
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