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摘要：通过平板筛选，从土壤中分离出1株菌株Y31，并对该菌株进行形态观察、生理生化试验、16S rDNA序列分析以及产物的薄层层析鉴定。结果表明，Y31菌株初步鉴定为短乳杆菌变种，能够以丙酸为唯一碳源发酵生产3-羟基丙酸。
关键词：3-羟基丙酸；分离；鉴定；短乳杆菌；薄层层析
中图分类号： Q939.9文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）09-0381-03
3-羟基丙酸（3-hydroxypropionic acid，别称β-hydroxypropionic acid，简写3-HP） 是一种重要的化工平台产品，被美国能源部列为当今世界12 种最具潜力的化工产品之一[1]。目前，3-HP主要通过丙烯酸水合法、β-丙内酯水解法等化学合成方法制备，在生产过程中依赖一些特殊条件，且具有一定的危险性[2]。而微生物技术方法逐渐成为当前3-HP生物合成的研究热点[3-6]，主要是通过自然选育、基因工程或代谢工程技术选育优良的3-HP产生菌。从自然环境中选育的3-HP菌株主要有克雷伯氏菌、假丝酵母、假单胞菌、罗伊氏乳杆菌和红串红球菌等[2，7-10]。为了获得其他具有潜在应用价值的3-HP产生菌，本研究从不同的土壤环境中分离产3-HP菌株，并通过形态观察、生理生化试验和16S rDNA序列分析等方法对分离菌株进行初步鉴定，以期为丰富产3-HP的微生物资源提供技术参考。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1样品土壤样品采集自果园、耕田、化工厂周边污水环境。
1.1.2培养基（1）初筛培养基：葡萄糖20 g/L、蛋白胨20 g/L、酵母膏10 g/L、琼脂20 g/L，pH值自然，高压灭菌后加入 0.1%～1.0% 丙酸。（2）复筛培养基：蛋白胨20 g/L、酵母膏 10 g/L、琼脂20 g/L、pH值自然，高压灭菌后加入05%丙酸。（3）发酵培养基：蛋白胨20 g/L、酵母膏10 g/L，pH值自然，高压灭菌后加入0.5%丙酸。（4）斜面培养基：葡萄糖20 g/L、蛋白胨20 g/L、酵母膏10 g/L、琼脂20 g/L，pH值自然。 菌落形态特征和生理生化试验所用培养基参考《微生物学实验教程》和《微生物学实验技术》等相关资料[11-12]。
1.1.3主要试剂DNA Marker购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司；Taq 酶、dNTP购自TaKaRa公司；3-HP标准品购自梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；细菌生理生化微量鉴定管购自杭州天和微生物试剂有限公司；TLC Silica gel 60 F254硅胶薄层层析板购自Merck公司；其他试剂均为国产分析纯。
1.2方法
1.2.1菌株初筛与复筛分别将样品少许放入100 mL含有玻璃珠的无菌水中，轻轻混匀后静置2 h，然后吸取0.1 mL悬浮液涂布于含有不同浓度丙酸的初筛培养基上。涂布完毕后，将平板倒置于30 ℃培养箱中放置24～72 h，用无菌牙签将初筛平板上的单个菌落转接到复筛培养基上，继续培养24～48 h，初步得到能够在复筛培养基中生长的菌株。将复筛的菌株分别接种于10 mL发酵培养基中，在30 ℃、160 r/min的摇床中发酵48 h。发酵结束后，离心去除菌体得到发酵上清液以备用。另外，通过薄层层析初步鉴定产3-HP的菌株进行纯培养，纯化后的菌株接种于斜面培养基中保存。
1.2.2菌株的形态学观察和生理生化试验参考《微生物学实验教程》和《微生物学实验技术》等相关资料对产3-HP菌株进行形态学观察和生理生化试验。本研究所进行的生理生化试验主要包括糖发酵试验、淀粉水解试验、脲酶测定、吲哚试验、过氧化氢酶试验、乙酰甲基甲醇试验（VP试验）以及甲基红试验（MR试验）等。
1.2.3菌株的16S rDNA序列测定及系统发育树构建菌株总DNA提取方法参考《精编分子生物学实验指南》[13]。16S rDNA的PCR扩增条件如下：引物使用细菌通用引物（27 F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492 R：5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′），20 μL的PCR扩增体系包括10×PCR buffer 2 μL、dNTP 0.8 μL、27 F和1492 R引物各 05 μL、模版DNA 1 μL、Taq酶0.3 μL、无菌水14.9 μL。PCR反应条件包括：94 ℃变性4 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸2 min，进行30个循环；最后72 ℃延伸10 min。
PCR产物送至北京奥科鼎盛生物科技有限公司测序，并将测得结果经由GenBank进行序列相似性搜索，然后采用Clustal X进行序列联配分析，系统发育分析通过软件MEGA 6.0完成。
1.2.4产物的薄层层析为初步确认所筛选的菌株是否产3-HP，通过薄层层析的方法进行检测分析，参照李冰等方法[14]并稍作修改，展开剂由正丁醇、甲酸和水按照 19 ∶1 ∶10 的体积比所构成，显色剂为0.1%溴甲酚绿，点样体积为2 μL。
2结果与分析
2.1菌株的初步分离和形态观察
将采集的样品进行多轮分离，最终得到1株能够在复筛培养基中生长良好菌株，将其命名Y31，划线分离出单菌落后进行发酵验证。从Y31菌落特征上看呈现乳白色、中间微凸起，48 h后呈淡黄色，不透明，直径小于0.5 mm（图1-A）。菌株Y31革兰氏染色结果呈阳性，油镜观察到的显微形态见图1-B，单个细胞呈棒形球杆状，两端钝圆，单个或成链状排列。
2.2菌株的生理生化特性
2.2.1糖发酵测试通过一系列生理生化试验指标对Y31菌株进行测定。结果表明，该菌可利用乳糖、葡萄糖、麦芽糖、鼠李糖且不产气，能液化明胶，不能利用棉籽糖、甘露醇（表1）。 表1糖发酵测试结果
糖类结果乳糖 葡萄糖 麦芽糖 棉籽糖-鼠李糖 甘露醇-明胶 注：“ ”表示能利用或能液化；“-”表示不能利用。
2.2.2其他方法测试淀粉水解试验、吲哚试验、乙酰甲基甲醇试验呈现阴性；脲酶测定试验、接触酶试验、甲基红试验为阳性（表2） 。生理生化测定结果结合形态学观察，并对照《伯杰氏细菌鉴定手册》（第8版）发现Y31菌株与短杆菌相似。
表2其他方法测试结果
试验结果淀粉水解-脲酶测定 吲哚-过氧化氢酶 VP-MR 注： “-”表示该试验为阴性；“ ”表示该试验为阳性。
2.3菌株分子生物学鉴定
按照《精编分子生物学实验指南》所述方法，提取Y31菌株的基因组DNA，然后利用细菌通用引物扩增该菌株的16S rDNA，经测序获得该菌株16S rDNA序列，片段大小为 1 430 bp。选择Genbank中与Y31菌株16S rDNA序列相似性较高的已知菌株的16S rDNA序列，并构建邻接树（N-J 法）。结果表明，菌株 Y31的16S rDNA序列与短乳杆菌具有较高的同源性，二者在以N-J 法构建的系统发育树上聚为同一簇群（图2），而通过生理生化试验指标分析发现，该菌株能够利用鼠李糖，不能够利用棉籽糖，另外该菌株能够在以丙酸为唯一碳源的培养基中生长，这与多数短乳杆菌有所不同，结合《伯杰氏细菌鉴定手册》（第8版），初步鉴定菌株Y31为短乳杆菌变种，命名为Lactobacillus brevis Y31。
2.4发酵产物的鉴定
将发酵液离心后获取发酵上清液，然后进行薄层层析分析，结果见图3。通过测量点样原点处到显色斑点中心距离与原点至溶剂前沿距离，得出每个斑点的比移值Rf。计算得出发酵液和对照3-HP的Rf值接近，符合薄层层析定性要求，因此，初步确定Y31菌株所产的酸为3-HP。
3结论与讨论
目前，化学法合成3-HP具有经济可行的优势，但从长久考虑，微生物法生产3-HP更加绿色环保。从相关文献来看，微生物源3-HP的研究主要通过基因工程和代谢工程技术构建3-HP的生物合成途径，并证实了某些微生物体内存在的3-HP代谢途径[1，15]。相关试验尚处于试验阶段，与生产应用还有一定距离。另外，从自然环境中分离的产3-HP菌株几乎都面临产物的毒性、耐受性问题，甚至构建的工程菌也存在相同的难题，有些基因工程菌还需依赖价格高昂辅酶B12[16]。
迄今已发现多种微生物能够利用不同的碳源产生3-HP，本试验从自然环境中分离出1种新发现的产3-HP菌株Y31，为该菌株的进一步选育创造了条件。通过形态观察、生理生化试验、分子生物学技术初步鉴定Y31菌株为短乳杆菌变种，为微生物源3-HP代谢网络研究提供一定的技术参考。
参考文献：
[1]Kumar V，Ashok S，Park S. Recent advances in biological production of 3-hydroxypropionic acid[J]. Biotechnology Advances，2013，31（6）：945-961.
[2]Lee S H，Park S J，Park O J，et al. Production of 3-hydroxypropionic acid from acrylic acid by newly isolated Rhodococcus erythropolis LG12[J]. Journal of Microbiology and Biotechnology，2009，19（5）：474-481.
[3]Thorgersen M P，Lipscomb G L，Schut G J，et al. Deletion of acetyl-CoA synthetases Ⅰ and Ⅱ increases production of 3-hydroxypropionate by the metabolically-engineered hyperthermophile Pyrococcus furiosus[J]. Metabolic Engineering，2014，22：83-88.
[4]Lee P，Subramanian M R，Zhou S F，et al. 3-Hydroxyisobutyrate dehydrogenase-Ⅰ from Pseudomonas denitrificans ATCC 13867 degrades 3-hydroxypropionic acid[J]. Biotechnology and Bioprocess Engineering，2014，19：1-7.
[5]Kim K，Kim S K，Park Y C，et al. Enhanced production of 3-hydroxypropionic acid from glycerol by modulation of glycerol metabolism in recombinant Escherichia coli[J]. Bioresource Technology，2014，156：170-175.
[6]Jung W S，Kang J H，Chu H S，et al. Elevated production of 3-hydroxypropionic acid by metabolic engineering of the glycerol metabolism in Escherichia coli[J]. Metabolic Engineering，2014，23：116-122.
[7]Dishisha T. Microbial production of bio-based chemicals[D]. Lund：Lund University，2013. [8]Arasu M V，Sarkar R，Sekar B S，et al. Isolation of a novel Pseudomonas species SP2 producing vitamin B12 under aerobic condition[J]. Biotechnology and Bioprocess Engineering，2013，18（1）：43-51.
[9]范俊英，方慧英，诸葛斌，等. 3-羟基丙酸高产菌株的筛选及诱变选育[J]. 微生物学通报，2012，39（9）：1355-1362.
[10]Wang X，Sa N，Wang F H，et al. Engineered constitutive pathway in klebsiella pneumoniae for 3-Hydroxypropionic acid production and implications for decoupling glycerol dissimilation pathways[J]. Current Microbiology，2013，66（3）：293-299.
[11]周德庆. 微生物学实验教程[M]. 北京：高等教育出版社，2006.
[12]杜连祥，路福平.微生物学实验技术[M]. 北京：中国轻工业出版社，2005.
[13]奥斯伯F M，布伦特R，金斯顿R E，等. 精编分子生物学实验指南[M]. 5版. 北京：科学出版社，2008.
[14]李冰，裴疆森. 3-羟基丙酸产生菌株的筛选及鉴定[J]. 食品与发酵工业，2010，36（4）：28-31.
[15]Valdehuesa K N，Liu H W，Nisola G M，et al. Recent advances in the metabolic engineering of microorganisms for the production of 3-hydroxypropionic acid as C3 platform chemical[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2013，97（8）：3309-3321.
[16]Bisaria V S，Kondo A. Microbial production of 3-hydroxypropionic acid from renewable sources：a green approach as an alternative to conventional chemistry[M]//Kumar V，Ashok S，Park S. Bioprocessing of renewable resources to commodity bioproducts. Hoboken，USA：Wiley，2014：381-407.
关键词：3-羟基丙酸；分离；鉴定；短乳杆菌；薄层层析
中图分类号： Q939.9文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）09-0381-03
3-羟基丙酸（3-hydroxypropionic acid，别称β-hydroxypropionic acid，简写3-HP） 是一种重要的化工平台产品，被美国能源部列为当今世界12 种最具潜力的化工产品之一[1]。目前，3-HP主要通过丙烯酸水合法、β-丙内酯水解法等化学合成方法制备，在生产过程中依赖一些特殊条件，且具有一定的危险性[2]。而微生物技术方法逐渐成为当前3-HP生物合成的研究热点[3-6]，主要是通过自然选育、基因工程或代谢工程技术选育优良的3-HP产生菌。从自然环境中选育的3-HP菌株主要有克雷伯氏菌、假丝酵母、假单胞菌、罗伊氏乳杆菌和红串红球菌等[2，7-10]。为了获得其他具有潜在应用价值的3-HP产生菌，本研究从不同的土壤环境中分离产3-HP菌株，并通过形态观察、生理生化试验和16S rDNA序列分析等方法对分离菌株进行初步鉴定，以期为丰富产3-HP的微生物资源提供技术参考。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1样品土壤样品采集自果园、耕田、化工厂周边污水环境。
1.1.2培养基（1）初筛培养基：葡萄糖20 g/L、蛋白胨20 g/L、酵母膏10 g/L、琼脂20 g/L，pH值自然，高压灭菌后加入 0.1%～1.0% 丙酸。（2）复筛培养基：蛋白胨20 g/L、酵母膏 10 g/L、琼脂20 g/L、pH值自然，高压灭菌后加入05%丙酸。（3）发酵培养基：蛋白胨20 g/L、酵母膏10 g/L，pH值自然，高压灭菌后加入0.5%丙酸。（4）斜面培养基：葡萄糖20 g/L、蛋白胨20 g/L、酵母膏10 g/L、琼脂20 g/L，pH值自然。 菌落形态特征和生理生化试验所用培养基参考《微生物学实验教程》和《微生物学实验技术》等相关资料[11-12]。
1.1.3主要试剂DNA Marker购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司；Taq 酶、dNTP购自TaKaRa公司；3-HP标准品购自梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；细菌生理生化微量鉴定管购自杭州天和微生物试剂有限公司；TLC Silica gel 60 F254硅胶薄层层析板购自Merck公司；其他试剂均为国产分析纯。
1.2方法
1.2.1菌株初筛与复筛分别将样品少许放入100 mL含有玻璃珠的无菌水中，轻轻混匀后静置2 h，然后吸取0.1 mL悬浮液涂布于含有不同浓度丙酸的初筛培养基上。涂布完毕后，将平板倒置于30 ℃培养箱中放置24～72 h，用无菌牙签将初筛平板上的单个菌落转接到复筛培养基上，继续培养24～48 h，初步得到能够在复筛培养基中生长的菌株。将复筛的菌株分别接种于10 mL发酵培养基中，在30 ℃、160 r/min的摇床中发酵48 h。发酵结束后，离心去除菌体得到发酵上清液以备用。另外，通过薄层层析初步鉴定产3-HP的菌株进行纯培养，纯化后的菌株接种于斜面培养基中保存。
1.2.2菌株的形态学观察和生理生化试验参考《微生物学实验教程》和《微生物学实验技术》等相关资料对产3-HP菌株进行形态学观察和生理生化试验。本研究所进行的生理生化试验主要包括糖发酵试验、淀粉水解试验、脲酶测定、吲哚试验、过氧化氢酶试验、乙酰甲基甲醇试验（VP试验）以及甲基红试验（MR试验）等。
1.2.3菌株的16S rDNA序列测定及系统发育树构建菌株总DNA提取方法参考《精编分子生物学实验指南》[13]。16S rDNA的PCR扩增条件如下：引物使用细菌通用引物（27 F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492 R：5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′），20 μL的PCR扩增体系包括10×PCR buffer 2 μL、dNTP 0.8 μL、27 F和1492 R引物各 05 μL、模版DNA 1 μL、Taq酶0.3 μL、无菌水14.9 μL。PCR反应条件包括：94 ℃变性4 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸2 min，进行30个循环；最后72 ℃延伸10 min。
PCR产物送至北京奥科鼎盛生物科技有限公司测序，并将测得结果经由GenBank进行序列相似性搜索，然后采用Clustal X进行序列联配分析，系统发育分析通过软件MEGA 6.0完成。
1.2.4产物的薄层层析为初步确认所筛选的菌株是否产3-HP，通过薄层层析的方法进行检测分析，参照李冰等方法[14]并稍作修改，展开剂由正丁醇、甲酸和水按照 19 ∶1 ∶10 的体积比所构成，显色剂为0.1%溴甲酚绿，点样体积为2 μL。
2结果与分析
2.1菌株的初步分离和形态观察
将采集的样品进行多轮分离，最终得到1株能够在复筛培养基中生长良好菌株，将其命名Y31，划线分离出单菌落后进行发酵验证。从Y31菌落特征上看呈现乳白色、中间微凸起，48 h后呈淡黄色，不透明，直径小于0.5 mm（图1-A）。菌株Y31革兰氏染色结果呈阳性，油镜观察到的显微形态见图1-B，单个细胞呈棒形球杆状，两端钝圆，单个或成链状排列。
2.2菌株的生理生化特性
2.2.1糖发酵测试通过一系列生理生化试验指标对Y31菌株进行测定。结果表明，该菌可利用乳糖、葡萄糖、麦芽糖、鼠李糖且不产气，能液化明胶，不能利用棉籽糖、甘露醇（表1）。 表1糖发酵测试结果
糖类结果乳糖 葡萄糖 麦芽糖 棉籽糖-鼠李糖 甘露醇-明胶 注：“ ”表示能利用或能液化；“-”表示不能利用。
2.2.2其他方法测试淀粉水解试验、吲哚试验、乙酰甲基甲醇试验呈现阴性；脲酶测定试验、接触酶试验、甲基红试验为阳性（表2） 。生理生化测定结果结合形态学观察，并对照《伯杰氏细菌鉴定手册》（第8版）发现Y31菌株与短杆菌相似。
表2其他方法测试结果
试验结果淀粉水解-脲酶测定 吲哚-过氧化氢酶 VP-MR 注： “-”表示该试验为阴性；“ ”表示该试验为阳性。
2.3菌株分子生物学鉴定
按照《精编分子生物学实验指南》所述方法，提取Y31菌株的基因组DNA，然后利用细菌通用引物扩增该菌株的16S rDNA，经测序获得该菌株16S rDNA序列，片段大小为 1 430 bp。选择Genbank中与Y31菌株16S rDNA序列相似性较高的已知菌株的16S rDNA序列，并构建邻接树（N-J 法）。结果表明，菌株 Y31的16S rDNA序列与短乳杆菌具有较高的同源性，二者在以N-J 法构建的系统发育树上聚为同一簇群（图2），而通过生理生化试验指标分析发现，该菌株能够利用鼠李糖，不能够利用棉籽糖，另外该菌株能够在以丙酸为唯一碳源的培养基中生长，这与多数短乳杆菌有所不同，结合《伯杰氏细菌鉴定手册》（第8版），初步鉴定菌株Y31为短乳杆菌变种，命名为Lactobacillus brevis Y31。
2.4发酵产物的鉴定
将发酵液离心后获取发酵上清液，然后进行薄层层析分析，结果见图3。通过测量点样原点处到显色斑点中心距离与原点至溶剂前沿距离，得出每个斑点的比移值Rf。计算得出发酵液和对照3-HP的Rf值接近，符合薄层层析定性要求，因此，初步确定Y31菌株所产的酸为3-HP。
3结论与讨论
目前，化学法合成3-HP具有经济可行的优势，但从长久考虑，微生物法生产3-HP更加绿色环保。从相关文献来看，微生物源3-HP的研究主要通过基因工程和代谢工程技术构建3-HP的生物合成途径，并证实了某些微生物体内存在的3-HP代谢途径[1，15]。相关试验尚处于试验阶段，与生产应用还有一定距离。另外，从自然环境中分离的产3-HP菌株几乎都面临产物的毒性、耐受性问题，甚至构建的工程菌也存在相同的难题，有些基因工程菌还需依赖价格高昂辅酶B12[16]。
迄今已发现多种微生物能够利用不同的碳源产生3-HP，本试验从自然环境中分离出1种新发现的产3-HP菌株Y31，为该菌株的进一步选育创造了条件。通过形态观察、生理生化试验、分子生物学技术初步鉴定Y31菌株为短乳杆菌变种，为微生物源3-HP代谢网络研究提供一定的技术参考。
参考文献：
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[10]Wang X，Sa N，Wang F H，et al. Engineered constitutive pathway in klebsiella pneumoniae for 3-Hydroxypropionic acid production and implications for decoupling glycerol dissimilation pathways[J]. Current Microbiology，2013，66（3）：293-299.
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[16]Bisaria V S，Kondo A. Microbial production of 3-hydroxypropionic acid from renewable sources：a green approach as an alternative to conventional chemistry[M]//Kumar V，Ashok S，Park S. Bioprocessing of renewable resources to commodity bioproducts. Hoboken，USA：Wiley，2014：381-407.