探讨人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞氧糖剥夺/恢复(OGD/R)模型中应激诱导蛋白Sestrin2基因过表达对线粒体分裂的调控作用及其机制。
方法(1)将SH-SY5Y细胞分为正常对照组、OGD/R组、Sestrin2过表达组及空载体组，后2组细胞预先采用慢病毒感染方法分别构建Sestrin2过表达及空载体稳转细胞株，除正常对照组细胞外均给予氧糖剥夺4 h/恢复18 h造模处理。造模完成后采用细胞计数试剂-8(CCK-8)法检测各组细胞的存活率，采用Western blotting实验检测各组细胞中Sestrin2、线粒体动力相关蛋白1(Drp1)、线粒体分裂蛋白1(Fis1)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、胞浆Kelch样环氧氯丙胺相关蛋白1(Keap1)、胞核核因子E2相关因子2(Nrf2)的蛋白水平，采用透射电镜观察各组细胞中线粒体的超微结构，采用免疫荧光染色检测各组细胞中Nrf2的核移位情况。(2)将Sestrin2过表达稳转SH-SY5Y细胞株分为Sestrin2过表达组、鸦胆子苦醇+Sestrin2过表达组、二甲基亚砜(DMSO)+Sestrin2过表达组，后2组细胞在造模前分别给予Keap1/Nrf2通路抑制剂鸦胆子苦醇(终浓度100 nmol/L)或DMSO溶液(终体积分数0.1%)预处理4 h，然后各组细胞均给予氧糖剥夺4 h/恢复18 h造模处理。造模完成后采用Western blotting实验检测各组细胞中胞浆Keap1、胞核Nrf2、Drp1、Fis1的蛋白水平。
结果(1)与OGD/R组相比，Sestrin2过表达组细胞的存活率明显升高（61.33%±1.15% vs. 81.00%±3.00%)，Bcl-2/Bax值明显升高（0.467±0.006 vs. 0.880±0.010)，Drp1、Fis1、胞浆Keap1蛋白水平明显降低（1.089±0.033 vs. 0.865±0.014；0.829±0.009 vs. 0.350±0.007；0.967±0.017 vs. 0.881±0.024)，胞核Nrf2蛋白水平明显升高(0.627±0.025 vs. 0.957±0.015)，差异均有统计学意义(P<0.05)；并且，Sestrin2过表达组细胞的线粒体结构明显较OGD/R组更完整，Nrf2发生了明显的核移位。(2)与Sestrin2过表达组相比，鸦胆子苦醇+Sestrin2过表达组细胞胞核Nrf2的蛋白水平明显降低(0.920±0.013 vs. 0.627±0.035)，Drp1、Fis1的蛋白水平明显升高（0.994±0.020 vs. 1.084±0.005；0.728±0.010 vs. 0.906±0.022)，差异均有统计学意义(P<0.05)。
结论Sestrin2基因过表达可下调胞浆Keap1蛋白水平、促进Nrf2核移位而激活Keap1/Nrf2通路，从而抑制线粒体分裂，减少细胞凋亡，减轻SH-SY5Y细胞的OGD/R损伤。