目的:建立同时测定活血镇痛膏中的防己诺林碱、粉防己碱、新乌头碱、乌头碱和次乌头碱含量的HPLC梯度洗脱法。方法:采用Dikma-C18色谱柱（200 mm×4.6 mm,5μm）,以甲醇-乙腈（3∶1）（A）与0.06%二乙胺水溶液（B）为流动相,进行梯度洗脱,检测波长分别为280 nm（防己诺林碱和粉防己碱）、235 nm（新乌头碱、乌头碱和次乌头碱）,流速1.0 ml·min^-1,柱温30℃,进样量为10μl。结果:防己诺林碱、粉防己碱、新乌头碱、乌头碱和次乌头碱5个成分的质量浓度分别在7.490¹49.800、14.610²92.200、4.150⁸3.000、5.250¹05.000、5.140¹02.800μg·ml^-1范围内呈良好线性关系,r分别为0.999 9,0.999 8,0.999 2,0.999 6,0.999 9;平均加样回收率（RSD）分别为99.87%（0.49%）,97.79%（1.11%）,96.97%（1.75%）,98.60%（1.50%）,97.94%（0.98%）（n=6）。结论:本文建立的HPLC梯度洗脱法能同时测定活血镇痛膏中的5个成分,该方法简便、稳定、可靠,可作为活血镇痛膏全面可靠的质量控制方法。