【摘 要】
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目的优化和评估粪便和组织样本高通量测序前处理方法，提高高通量测序在宏病毒组研究中的灵敏度。方法针对粪便样本，选取经粪便排毒的5种病毒阳性样本混合模拟样本，对不同材质的滤器、核酸酶不同处理时间、不同的提取核酸方法进行评价。针对组织样本，选取动物组织中检出的2种病毒阳性样本，对过滤、核酸酶处理和不同的核酸提取方法进行评价。采用TaqManreal-timePCR定量方法评价每步处理对每一种模式病毒核酸载量的影响，采用SYBRGreenreal-timePCR方法对细菌16SrRNA基因和宿主12SrRNA基因
【机 构】
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甘肃中医药大学公共卫生学院，兰州 730000;中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所，北京 100052中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所，北京 100052;华北理工大学基础医学院，唐山 0630
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目的优化和评估粪便和组织样本高通量测序前处理方法，提高高通量测序在宏病毒组研究中的灵敏度。
方法针对粪便样本，选取经粪便排毒的5种病毒阳性样本混合模拟样本，对不同材质的滤器、核酸酶不同处理时间、不同的提取核酸方法进行评价。针对组织样本，选取动物组织中检出的2种病毒阳性样本，对过滤、核酸酶处理和不同的核酸提取方法进行评价。采用TaqMan real-time PCR定量方法评价每步处理对每一种模式病毒核酸载量的影响，采用SYBR Green real-time PCR方法对细菌16S rRNA基因和宿主12S rRNA基因进行定量以评价细菌和宿主的去除效果。
结果对于粪便样本，使用0.22 μm的PES滤器过滤效果较好，使用PVDF材质滤器导致样本量减少；核酸酶消化2 h比消化1 h去除细菌的效果更好，且病毒损失较少；使用RPMK试剂盒可以有效减少细菌，但对部分病毒提取效果较差，而MVSK试剂盒提取病毒核酸效果较好。对于组织样本，使用0.22 μm的PES滤器过滤病毒损失较少；核酸酶消化1 h可以有效去除宿主gDNA，且病毒损失较少；使用VNAEK II试剂盒提取病毒核酸效果最好，Trizol LS RPMK方法去除宿主gDNA效果较好，但病毒损失较大。粪便和组织样本的前处理方法整个流程的病毒损失分别为(1.7-3.0)Ct和(1.6-2.5)Ct。
结论粪便样本最佳方法为PES滤器过滤、核酸酶消化2 h、MVSK试剂盒提取核酸；组织样本最佳方法为PES滤器过滤、核酸酶消化1 h、VNAEK II试剂盒提取核酸。
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