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目的:制备靶向EGFRvⅢ的第三代CAR-T（EGFRvⅢ/3CAR-T）,检测其在体外和体内对EGFRvⅢ+U87胶质瘤细胞的特异性杀伤效应。方法:用磷酸钙沉淀法将三质粒共转染HEK293T细胞包装EGFRvⅢ/3CAR慢病毒（LV-EGFRvⅢ/3CAR）,感染健康人CD3+T细胞,Western blotting和流式细胞术检测T细胞中EGFRvⅢ/3CAR的表达水平,51Cr释放法检测EGFRvⅢ/3CART对EGFRvⅢ+U87细胞的体外杀伤效应,ELISA法检测EGFRvⅢ/3CAR+T的IFN-γ分泌水平。构建裸鼠异种胶质瘤移植模型,检测EGFRvⅢ/3CAR-T对移植瘤的体内杀伤活性。结果:EGFRvⅢ/3CAR慢病毒包装成功,滴度值为5×106TU/ml。Western blotting在相对分子质量58 000处检测到EGFRvⅢ/3CAR表达,未转导组无相同分子量蛋白表达。流式细胞术检测结果显示EGFRvⅢ/3CAR转导效率平均为52.3%,51Cr释放法检测EGFRvⅢ/3CAR-T特异性杀伤作用与E∶T值（E∶T为4∶1、为8∶1、16∶1、32∶1）呈正比关系。ELISA法检测到细胞因子IFN-γ分泌量为（1 836±148.2）pg/ml,与NT T和GFP+T细胞相比差异有统计学意义（P<0.01）。EGFRvⅢ/3CAR+T细胞的特异性杀伤活性及IFN-γ分泌均依赖于EGFRvⅢ在U87细胞中的表达水平。体内肿瘤生长检测结果显示,注射后3周EGFRvⅢ/3CAR+T组肿瘤体积较GFP+T细胞和PBS组差异有统计学意义（P<0.01）。结论:EGFRvⅢ/3CAR-T在体外和体内均能发挥靶向杀伤EGFRvⅢ+脑胶质瘤细胞的作用,为后续临床试验提供依据。