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摘 要：以3份大白菜杂交种及其亲本为试验材料，利用改良CTAB法提取基因组DNA，采用正交设计对Mg2+、dNTPs、引物、模板DNA和Taq酶5因素4水平进行优化，结果表明，适用于大白菜纯度鉴定EST-SSR检测体系为：在10 μL反应体系中包含3.0 mmol·L-1 MgCl2、 400 μmol·L-1 dNTPs、0.20 μmol·L-1 SSR 引物、4 ng模板DNA和0.05 U Taq酶。利用该优化的体系，对3份大白菜杂交种进行单株育苗试验，每份杂交种取单株140株进行纯度鉴定。结果显示，扩增带型清晰、稳定，纯度检测结果与田间试验结果基本吻合，可用于大白菜种子纯度分子标记的进一步研究。
关键词：大白菜；纯度鉴定；正交设计；EST-SSR；优化
中图分类号：S634.1 文献标识码：A DOI编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2013.03.001
大白菜（Brassica campestris L. ssp. pekinensis）是十字花科芸薹属 一年生草本植物，原产地中海沿岸和中国，栽培面积和消费量在中国居各类蔬菜之首。在大白菜杂交种生产与销售过程中，建立以质量检测为中心的良种繁殖与种子管理体系，对稳定和推广优良品种起着重要作用。目前，大白菜杂交种纯度鉴定直接可靠的方法是田间小区种植鉴定，但这一方法易受环境的影响，时间长，且费工占地。理想的种子纯度鉴定技术不但要准确可靠，还要简单、快速、经济、实用性强，这是种子纯度鉴定实现商业化的前提，也是该技术的发展趋势。近年来，植物分子生物学的迅猛发展使人们对作物的分析进入了分子水平，DNA分子标记技术因其能更有效地鉴别不同的甚至亲缘关系很近的基因型，在分析生物遗传多样性、构建品种指纹图谱和种子纯度鉴定等方面已成为更加理想的方法。
SSR（Simple Sequence Repeats）即简单序列重复，又称微卫星标记（microsatellite），是由少数几个核苷酸（一般为 1～6个）为重复单位组成的串联重复序列[1-2]。它广泛分布在真核生物的基因组中，并在两侧都有物种特异性的侧翼序列，鉴于基序的重复次数变化很大，因此，与其他DNA分子标记相比具有更高的多态性。由于其具有数量丰富、重复性好、可靠性高、呈共显性遗传、易于分析等特点，可用来高效、准确地检测生物体中的遗传变异。随着功能基因组学的迅速发展，GenBank中积累了许多重要物种的大量EST序列，这些序列获取简便，没有任何费用，已经成为发展SSR标记的重要来源，因此，基于表达序列标签（expressed sequence tags，EST）的微卫星（simple sequence repeats，SSR）标记技术不仅保留了SSR标记技术的所有优点，而且凸显了其便捷、花费低、效率高的优势[3-4]。
利用EST-SSR技术对植物基因组研究时应对该物种的EST-SSR反应体系进行优化，以建立一套适用于该物种的EST-SSR检测体系。目前，EST-SSR技术虽然已用于大白菜品种鉴定和种质资源分析的研究[5]，但有关大白菜纯度鉴定中EST-SSR检测体系及其优化方法的研究报道较少。本研究从PCR扩增的关键影响因素对EST-SSR体系进行优化，以建立一套稳定、准确的适用于大白菜纯度鉴定的EST-SSR检测体系，为大白菜种质资源研究、品种鉴定和遗传图谱构建等研究奠定基础。
1 材料和方法
1.1 试验材料
试验材料为3份市售大白菜杂交种及其亲本，具体名称如表1所示。
1.2 试验方法
1.2.1 基因组DNA的提取 采用M. Somma等提出的CTAB法。每个品种随机挑取200粒均匀、饱满的种子，将其催芽，光照培养，待长出真叶后，采集幼嫩单株140株进行DNA提取。利用NanoDrop Spectrophotometer ND-1000核酸蛋白测定仪和1.5%琼脂糖凝胶电泳检测所提取的DNA浓度和质量，并将其稀释为50 ng·μL-1，-20 ℃保存备用。
1.2.2 EST-SSR位点选择 在前期研究基础上[4]，选择多态性较强的BC1位点作为优化的对象。该位点可对3份大白菜杂交种进行纯度鉴定，通过互为差异的特征谱带，寻找杂交种特征谱带带型为双亲互补带型的引物，确定引物BC1可以同时对3份大白菜杂交种进行纯度鉴定。位点信息及PCR引物序列详见表2。
1.2.3 SSR-PCR 反应体系的优化 以大白菜 2 号及其亲本为试验材料，选用已开发引物BC1，应用L16（ 45 ） 正交试验设计（表3）， 对Mg2+ 浓度、dNTP、引物浓度、模板浓度、Taq DNA 聚合酶进行 5 因素 4 水平上的筛选， 以确定最佳组合，其中各处理均为10 μL反应体系，除表中各变化因素外，每个处理中还含有1 μL 10×PCR Buffer（Mg2+ free），加ddH2O补足10 μL，试验设 2 个重复。
1.2.4 SSR-PCR扩增程序 在ABI Veriti梯度PCR扩增仪上进行，94 ℃预变性5 min，94 ℃变性60 s，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，35 个循环，72 ℃延伸7 min后于4 ℃保存。PCR扩增产物于-20 ℃冰箱保存。
1.2.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳。电泳仪采用BIO-RAD 3000 高压电泳仪。电泳条件为：先100 V 10 min，后调整为250 V 30 min，上样量为1 μL。银染：染色8 min （加入6 mL10%硝酸银溶液，现用现配）、漂洗（不超过15 s）、显影（加入9 g氢氧化钠，临用前加入3 mL甲醛溶液）、终止、清洗；扫描成像并记录结果。
1.2.6 反应体系稳定性检测 利用优化的体系，对可用引物BC1进行纯度鉴定的 3 份大白菜杂交种进行单株育苗试验，每个品种选取单株幼苗 140 株进行纯度鉴定，统计结果并与田间试验结果进行对比，从而确定所优化体系的可用性、稳定性及准确性。 2 结果与分析
2.1 基因组DNA提取与检测
DNA的提取是进行PCR的基础步骤与环节，其质量的好坏直接关系到试验的成败。本试验采用改良CTAB法提取纯化得到质量较高的基因组DNA（图1），主带清晰，无拖尾带，无杂质及RNA干扰，纯度较高，可很好地应用于大白菜纯度鉴定EST-SSR检测体系优化。
2.2 PCR扩增反应体系的优化
按表3设计的16个处理进行EST-SSR反应后，获得的产物进行8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果见图2。从图2可以看出，在16个处理中均能扩增出产物，处理2、7、12、13、14扩增主带位置出现较强非特异性谱带干扰；处理5、6、9、10、11、15灵敏度过高，特征谱带较深，非特异性扩增明显；处理1、4、8、16中处理16灵敏度相对适中，非特异性谱带较少，主带清晰突出，为本研究最佳组合。因此，该组合所用PCR反应体系为最佳体系，即在10 μL反应体系中包含3.0 mmol·L-1 MgCl2、 400 μmol·L-1 dNTPs、0.20 μmol·L-1 SSR 引物、4 ng模板DNA和0.05 U Taq酶。
2.3 反应体系稳定性检测
对3份大白菜杂交种进行随机育苗试验，每份杂交种提取单株140株，利用引物BC1进行EST-SSR分子标记纯度鉴定。纯度鉴定结果如图3～5。大白菜‘秋绿75’不纯单株3株，不纯单株编号为4、18、26，种子纯度为97.85%；大白菜‘秋绿60’不纯单株2株，不纯单株编号为1、16，种子纯度为98.57%；大白菜‘津白56’不纯单株3株，不纯单株编号为9、10、26，种子纯度为97.85%。所得纯度结果与传统田间纯度鉴定结果基本一致，从而确保所筛选引物和建立体系的可靠性及稳定性。
3 讨 论
目前，种子纯度鉴定技术为适应商业化育种的需要已经逐渐发展到分子水平，随着近年来GenBank上公布的常见物种EST序列的日益增多，及SSR引物设计软件的不断更新完善，使得EST-SSR标记技术凸显了其多态性高、特异性强、呈现共显性的特点，同时由于其还具有获取便捷、信息量大、花费低、效率高等优势，已广泛应用于水稻、小麦、大麦、葡萄、玉米、甘蔗等植物分子连锁图谱的构建和遗传多样性分析[6-10]。
利用正交试验设计对EST-SSR反应体系进行优化，反应体系中的Mg2+ 浓度、dNTP、引物浓度、模板浓度、Taq DNA 聚合酶各因素均会对反应结果造成影响，从单因素变量考虑，一般认为引物浓度越大，扩增产物浓度越高，但同时产生非特异性扩增、引物二聚体、甚至碱基错配的几率也越大；DNA模板浓度过高，有可能会过早的消耗尽引物，造成随机延伸或终止，出现背景弥散或加重，但一般而言模板的量只要不是极度过多或过少，对反应体系造成的影响不是十分显著；Taq酶浓度会影响扩增效率，酶浓度过高会产生错配扩增。而对于多因素变量而言，很难确定在某一处理中单因素所起的影响整体反应结果的作用，因为各因素之间存在着微妙的相互结合、消耗和竞争的共同作用效果，比如Taq酶的活性决定于Mg2+的浓度，而作为PCR反应的重要底物dNTPs，当其含量不足时将直接影响PCR反应的进行，但它能与Mg2+结合，当其含量过高时将与Taq酶竞争Mg2+，使Taq酶活性下降，扩增产物减少，因此，Mg2+和dNTPs浓度的变化对最后的扩增结果影响较大。因此，在实际操作中，应根据试验情况进行选择或做适当调整[11-13]。
利用正交试验设计对大白菜EST-SSR反应体系进行优化，目的是得到主带单一、清晰、稳定、非特异性扩增较少的谱带，用于纯度判定。正交试验设计是研究多因素多水平的一种设计方法，它根据正交性从全面试验中挑选出部分有代表性的点进行试验，这些有代表性的点具备了均衡分散性、齐整可比性的特点，可有效解决理论上需要进行的试验次数与实际可行试验次数之间的矛盾。科学地提高了试验效率，从而确定了大白菜EST-SSR纯度鉴定的优化体系，为大白菜分子标记纯度鉴定的进一步研究奠定了基础。
参考文献：
[1] 郭宝生，张建宏，刘素恩，等.棉花品种分子标记遗传多样性检测[J].华北农学报，2010（S1）：47-49.
[2] 李丽，王海岗，张晓丽，等.SSR分子标记在作物遗传育种中的应用[J].山西农业科学，2008（3）：15-18.
[3] 兰青阔，李欧静，张继波，等. 津南芹菜EST-SSR指纹图谱的构建及遗传差异分析[J].天津农业科学，2012，18（5）：7-11.
[4] 赵新，王永，兰青阔，等. EST-SSR标记在大白菜杂交种种子纯度鉴定中的应用[J].分子植物育种，2012（10）：1145-1150.
[5] 赵美华，逯保德，兰创业，等.大白菜种质资源遗传多样性分析[J].山西农业科学，2011（1）：12-16.
[6] Cho Y G， Ishil T， Tenmykh S， et al. Diversity of microsatellites derived from genomic libraries and Gen Bank sequences in rice（Oryza sativa L.）[J].Theoretical and Applied Genetics，2000，100：713-722.
[7] Nicot N， Chiquet V， Gandon B， et al. Study of simple sequence repeat （SSR）markers from wheat expressed sequence tags（ESTs）[J].Theoretical and Applied Genetics，2004，109：800-805.
[8] Thiel T， Michalek W， Varshney R K ， et al. Exploiting EST databases for the development and characterization of gene-derived SSR-markers in barley （Hordeum vulgare L .）[J].Theoretical and Applied Genetics，2003，106（3）：412-422.
[9] Xu Y， Ma R C， Xie H， et al. Development of SSR markers for the phylogenetic analysis of almond trees from China and the Mediterranean region[J]. Genome， 2004， 47：1091-1104.
[10] 杨春霞，温强，叶金山，等. 枳壳EST-SSR标记的开发[J]. 分子植物育种，2011，9 （1）：123-127.
[11] 石磊，李丽，郑晓鹰，等. 大白菜SSR检测体系的优化[J]. 分子植物育种，2007，5（1）：110-116.
[12] 佟海申，宋琳，张志刚，等.大白菜EST—SSR反应体系优化及引物[J].科技导报，2010，28（3）：73-81.
[13] 吴春燕，高义，宋廷宇，等.正交设计优化大白菜ISSRPCR反应体系[J].北方园艺，2012（5）：127-129.
关键词：大白菜；纯度鉴定；正交设计；EST-SSR；优化
中图分类号：S634.1 文献标识码：A DOI编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2013.03.001
大白菜（Brassica campestris L. ssp. pekinensis）是十字花科芸薹属 一年生草本植物，原产地中海沿岸和中国，栽培面积和消费量在中国居各类蔬菜之首。在大白菜杂交种生产与销售过程中，建立以质量检测为中心的良种繁殖与种子管理体系，对稳定和推广优良品种起着重要作用。目前，大白菜杂交种纯度鉴定直接可靠的方法是田间小区种植鉴定，但这一方法易受环境的影响，时间长，且费工占地。理想的种子纯度鉴定技术不但要准确可靠，还要简单、快速、经济、实用性强，这是种子纯度鉴定实现商业化的前提，也是该技术的发展趋势。近年来，植物分子生物学的迅猛发展使人们对作物的分析进入了分子水平，DNA分子标记技术因其能更有效地鉴别不同的甚至亲缘关系很近的基因型，在分析生物遗传多样性、构建品种指纹图谱和种子纯度鉴定等方面已成为更加理想的方法。
SSR（Simple Sequence Repeats）即简单序列重复，又称微卫星标记（microsatellite），是由少数几个核苷酸（一般为 1～6个）为重复单位组成的串联重复序列[1-2]。它广泛分布在真核生物的基因组中，并在两侧都有物种特异性的侧翼序列，鉴于基序的重复次数变化很大，因此，与其他DNA分子标记相比具有更高的多态性。由于其具有数量丰富、重复性好、可靠性高、呈共显性遗传、易于分析等特点，可用来高效、准确地检测生物体中的遗传变异。随着功能基因组学的迅速发展，GenBank中积累了许多重要物种的大量EST序列，这些序列获取简便，没有任何费用，已经成为发展SSR标记的重要来源，因此，基于表达序列标签（expressed sequence tags，EST）的微卫星（simple sequence repeats，SSR）标记技术不仅保留了SSR标记技术的所有优点，而且凸显了其便捷、花费低、效率高的优势[3-4]。
利用EST-SSR技术对植物基因组研究时应对该物种的EST-SSR反应体系进行优化，以建立一套适用于该物种的EST-SSR检测体系。目前，EST-SSR技术虽然已用于大白菜品种鉴定和种质资源分析的研究[5]，但有关大白菜纯度鉴定中EST-SSR检测体系及其优化方法的研究报道较少。本研究从PCR扩增的关键影响因素对EST-SSR体系进行优化，以建立一套稳定、准确的适用于大白菜纯度鉴定的EST-SSR检测体系，为大白菜种质资源研究、品种鉴定和遗传图谱构建等研究奠定基础。
1 材料和方法
1.1 试验材料
试验材料为3份市售大白菜杂交种及其亲本，具体名称如表1所示。
1.2 试验方法
1.2.1 基因组DNA的提取 采用M. Somma等提出的CTAB法。每个品种随机挑取200粒均匀、饱满的种子，将其催芽，光照培养，待长出真叶后，采集幼嫩单株140株进行DNA提取。利用NanoDrop Spectrophotometer ND-1000核酸蛋白测定仪和1.5%琼脂糖凝胶电泳检测所提取的DNA浓度和质量，并将其稀释为50 ng·μL-1，-20 ℃保存备用。
1.2.2 EST-SSR位点选择 在前期研究基础上[4]，选择多态性较强的BC1位点作为优化的对象。该位点可对3份大白菜杂交种进行纯度鉴定，通过互为差异的特征谱带，寻找杂交种特征谱带带型为双亲互补带型的引物，确定引物BC1可以同时对3份大白菜杂交种进行纯度鉴定。位点信息及PCR引物序列详见表2。
1.2.3 SSR-PCR 反应体系的优化 以大白菜 2 号及其亲本为试验材料，选用已开发引物BC1，应用L16（ 45 ） 正交试验设计（表3）， 对Mg2+ 浓度、dNTP、引物浓度、模板浓度、Taq DNA 聚合酶进行 5 因素 4 水平上的筛选， 以确定最佳组合，其中各处理均为10 μL反应体系，除表中各变化因素外，每个处理中还含有1 μL 10×PCR Buffer（Mg2+ free），加ddH2O补足10 μL，试验设 2 个重复。
1.2.4 SSR-PCR扩增程序 在ABI Veriti梯度PCR扩增仪上进行，94 ℃预变性5 min，94 ℃变性60 s，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，35 个循环，72 ℃延伸7 min后于4 ℃保存。PCR扩增产物于-20 ℃冰箱保存。
1.2.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳。电泳仪采用BIO-RAD 3000 高压电泳仪。电泳条件为：先100 V 10 min，后调整为250 V 30 min，上样量为1 μL。银染：染色8 min （加入6 mL10%硝酸银溶液，现用现配）、漂洗（不超过15 s）、显影（加入9 g氢氧化钠，临用前加入3 mL甲醛溶液）、终止、清洗；扫描成像并记录结果。
1.2.6 反应体系稳定性检测 利用优化的体系，对可用引物BC1进行纯度鉴定的 3 份大白菜杂交种进行单株育苗试验，每个品种选取单株幼苗 140 株进行纯度鉴定，统计结果并与田间试验结果进行对比，从而确定所优化体系的可用性、稳定性及准确性。 2 结果与分析
2.1 基因组DNA提取与检测
DNA的提取是进行PCR的基础步骤与环节，其质量的好坏直接关系到试验的成败。本试验采用改良CTAB法提取纯化得到质量较高的基因组DNA（图1），主带清晰，无拖尾带，无杂质及RNA干扰，纯度较高，可很好地应用于大白菜纯度鉴定EST-SSR检测体系优化。
2.2 PCR扩增反应体系的优化
按表3设计的16个处理进行EST-SSR反应后，获得的产物进行8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果见图2。从图2可以看出，在16个处理中均能扩增出产物，处理2、7、12、13、14扩增主带位置出现较强非特异性谱带干扰；处理5、6、9、10、11、15灵敏度过高，特征谱带较深，非特异性扩增明显；处理1、4、8、16中处理16灵敏度相对适中，非特异性谱带较少，主带清晰突出，为本研究最佳组合。因此，该组合所用PCR反应体系为最佳体系，即在10 μL反应体系中包含3.0 mmol·L-1 MgCl2、 400 μmol·L-1 dNTPs、0.20 μmol·L-1 SSR 引物、4 ng模板DNA和0.05 U Taq酶。
2.3 反应体系稳定性检测
对3份大白菜杂交种进行随机育苗试验，每份杂交种提取单株140株，利用引物BC1进行EST-SSR分子标记纯度鉴定。纯度鉴定结果如图3～5。大白菜‘秋绿75’不纯单株3株，不纯单株编号为4、18、26，种子纯度为97.85%；大白菜‘秋绿60’不纯单株2株，不纯单株编号为1、16，种子纯度为98.57%；大白菜‘津白56’不纯单株3株，不纯单株编号为9、10、26，种子纯度为97.85%。所得纯度结果与传统田间纯度鉴定结果基本一致，从而确保所筛选引物和建立体系的可靠性及稳定性。
3 讨 论
目前，种子纯度鉴定技术为适应商业化育种的需要已经逐渐发展到分子水平，随着近年来GenBank上公布的常见物种EST序列的日益增多，及SSR引物设计软件的不断更新完善，使得EST-SSR标记技术凸显了其多态性高、特异性强、呈现共显性的特点，同时由于其还具有获取便捷、信息量大、花费低、效率高等优势，已广泛应用于水稻、小麦、大麦、葡萄、玉米、甘蔗等植物分子连锁图谱的构建和遗传多样性分析[6-10]。
利用正交试验设计对EST-SSR反应体系进行优化，反应体系中的Mg2+ 浓度、dNTP、引物浓度、模板浓度、Taq DNA 聚合酶各因素均会对反应结果造成影响，从单因素变量考虑，一般认为引物浓度越大，扩增产物浓度越高，但同时产生非特异性扩增、引物二聚体、甚至碱基错配的几率也越大；DNA模板浓度过高，有可能会过早的消耗尽引物，造成随机延伸或终止，出现背景弥散或加重，但一般而言模板的量只要不是极度过多或过少，对反应体系造成的影响不是十分显著；Taq酶浓度会影响扩增效率，酶浓度过高会产生错配扩增。而对于多因素变量而言，很难确定在某一处理中单因素所起的影响整体反应结果的作用，因为各因素之间存在着微妙的相互结合、消耗和竞争的共同作用效果，比如Taq酶的活性决定于Mg2+的浓度，而作为PCR反应的重要底物dNTPs，当其含量不足时将直接影响PCR反应的进行，但它能与Mg2+结合，当其含量过高时将与Taq酶竞争Mg2+，使Taq酶活性下降，扩增产物减少，因此，Mg2+和dNTPs浓度的变化对最后的扩增结果影响较大。因此，在实际操作中，应根据试验情况进行选择或做适当调整[11-13]。
利用正交试验设计对大白菜EST-SSR反应体系进行优化，目的是得到主带单一、清晰、稳定、非特异性扩增较少的谱带，用于纯度判定。正交试验设计是研究多因素多水平的一种设计方法，它根据正交性从全面试验中挑选出部分有代表性的点进行试验，这些有代表性的点具备了均衡分散性、齐整可比性的特点，可有效解决理论上需要进行的试验次数与实际可行试验次数之间的矛盾。科学地提高了试验效率，从而确定了大白菜EST-SSR纯度鉴定的优化体系，为大白菜分子标记纯度鉴定的进一步研究奠定了基础。
参考文献：
[1] 郭宝生，张建宏，刘素恩，等.棉花品种分子标记遗传多样性检测[J].华北农学报，2010（S1）：47-49.
[2] 李丽，王海岗，张晓丽，等.SSR分子标记在作物遗传育种中的应用[J].山西农业科学，2008（3）：15-18.
[3] 兰青阔，李欧静，张继波，等. 津南芹菜EST-SSR指纹图谱的构建及遗传差异分析[J].天津农业科学，2012，18（5）：7-11.
[4] 赵新，王永，兰青阔，等. EST-SSR标记在大白菜杂交种种子纯度鉴定中的应用[J].分子植物育种，2012（10）：1145-1150.
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[6] Cho Y G， Ishil T， Tenmykh S， et al. Diversity of microsatellites derived from genomic libraries and Gen Bank sequences in rice（Oryza sativa L.）[J].Theoretical and Applied Genetics，2000，100：713-722.
[7] Nicot N， Chiquet V， Gandon B， et al. Study of simple sequence repeat （SSR）markers from wheat expressed sequence tags（ESTs）[J].Theoretical and Applied Genetics，2004，109：800-805.
[8] Thiel T， Michalek W， Varshney R K ， et al. Exploiting EST databases for the development and characterization of gene-derived SSR-markers in barley （Hordeum vulgare L .）[J].Theoretical and Applied Genetics，2003，106（3）：412-422.
[9] Xu Y， Ma R C， Xie H， et al. Development of SSR markers for the phylogenetic analysis of almond trees from China and the Mediterranean region[J]. Genome， 2004， 47：1091-1104.
[10] 杨春霞，温强，叶金山，等. 枳壳EST-SSR标记的开发[J]. 分子植物育种，2011，9 （1）：123-127.
[11] 石磊，李丽，郑晓鹰，等. 大白菜SSR检测体系的优化[J]. 分子植物育种，2007，5（1）：110-116.
[12] 佟海申，宋琳，张志刚，等.大白菜EST—SSR反应体系优化及引物[J].科技导报，2010，28（3）：73-81.
[13] 吴春燕，高义，宋廷宇，等.正交设计优化大白菜ISSRPCR反应体系[J].北方园艺，2012（5）：127-129.