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摘要：采用固体培养基培养法研究了培养温度、pH值和贮藏方式对大喇叭杜鹃花粉萌发的影响，结果表明：培养温度对大喇叭杜鹃花粉萌发的影响较大，25～30 ℃下培养，大喇叭杜鹃花粉的萌发生长较好，且以25 ℃最佳；花粉在外源pH值为4～6的条件下能够正常萌发，且最适合其萌发的pH值为4.5～5.0，萌发率达87%；室温、4 ℃、-18 ℃等3种贮藏方式中以-18 ℃的贮藏效果最佳，贮藏4个月后的花粉萌发率仍有68.3%。
关键词：大喇叭杜鹃；花粉萌发；温度；pH值；贮藏
中图分类号： S685.210.1 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）07-0186-02
收稿日期：2013-10-22
基金项目：云南省科技计划（编号：2011EB110）。
作者简介：陆琳（1976—），女，云南昆明人，高级实验师，主要从事云南特色园林花卉的种质资源创新研究。Tel：（0871）65892602；E-mail：Lu_lin2005@sina.com。
通信作者：李树发，男，硕士，研究员，主要从事云南特色花卉新品种选育及产业化开发应用研究。Tel：（0871）65892602；E-mail：lsf206498@126.com。云南省是杜鹃花的世界分布中心之一，有着丰富的种质资源[1-3]。大喇叭杜鹃（Rhododendron excellens Hemsl.et Wils.）为杜鹃花科杜鹃花属常绿灌木，主要分布在云南省内，且分布范围较小而集中，大部分分布于滇东南地区的文山州境内，在玉溪和红河以及临沧也有少量分布。大喇叭杜鹃花大而密集，花形独特，具有较高的观赏价值，是培育高山杜鹃大花品种的优良亲本资源[4-5]。花粉活力直接与育种效率有关，而杜鹃花花粉活力及其贮藏方法的研究是开展高山杜鹃良种培育的前提。经研究发现，不同植物的花粉萌发条件不尽相同[6]，如苹果属（Malus）植物花粉在pH值 4.0～9.0之间都能正常萌发[7]；Holdaway-Clarke 等研究发现，台湾百合花粉的萌发与生长都会受外源pH值变化的影响[8]。目前国内外尚无大喇叭杜鹃花粉的萌发条件及贮藏方法的相关报道。本研究通过对大喇叭杜鹃花粉的萌发温度、pH值、贮藏温度及其贮藏时间进行研究，拟探讨大喇叭杜鹃花粉萌发所需的条件，了解其花粉的贮藏耐性，旨在解决花期不遇、异地授粉等杂交中的实际困难，为高山杜鹃的杂交育种提供科学依据和技术指导。
1材料与方法
1.1试验材料
試验在云南省农业科学院花卉研究所的实验室内进行，试验材料大喇叭杜鹃花粉采自云南省麻栗坡县下金厂乡干坝子，地理位置23°07′27.58″N、104°49′21.70″E，海拔1 858～1 891 m。
1.2试验方法
1.2.1花粉粒的收集于散粉前采集大喇叭杜鹃的花药，采用阴干法置于硅胶中干燥24～48 h，见花粉粒分离开时采集花粉。
1.2.2花粉生活力的测定采用花粉离体萌发法测定花粉的生活力，离体培养法的培养基配方为50 g/L蔗糖+50 mg/L硼酸+50 mg/L氯化钙+0.7%琼脂。用玻璃棒加1～2滴培养液于载玻片上，稍冷却后用干净的毛笔蘸取少许花粉均匀撒播于培养基表面，置于25 ℃恒温培养箱中，黑暗条件下培养6 h后观察花粉萌发情况。每个处理设4次重复（即培养4个载玻片），每个重复选取2个随机视野（本试验采用200倍视野），每个视野中应不少于50粒花粉，记录发芽率，相关计算公式如下。
发芽率=视野内已发芽的花粉数/视野内的花粉粒总数×100%。
1.2.3不同温度条件对花粉萌发率的影响在5、10、15、20、25、30、35、40 ℃条件下培养大喇叭杜鹃花粉。6 h后在显微镜下观察并统计花粉萌发率，比较不同温度条件下花粉萌发率的差异。
1.2.4外源pH值梯度的设定采用花粉培养基（测定pH值为5.6），用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl对培养基的pH值进行梯度调节，分别设pH值为3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、60、6.5、7.0、7.5。
1.2.5不同贮藏条件及不同贮藏时间下花粉萌发力的测定将干燥后的花粉分别装入45个1.5 mL的离心管中，每个处理设3次重复。为了避免湿度的影响，在离心管中预先铺1层扇形的吸水纸，并采用以下3种方法密封保存大喇叭杜鹃花粉：常温保存、4 ℃冰箱保存、-18 ℃冰箱保存。从花粉贮藏起开始，每隔一定时间（1、2、4、5、6个月）定期检测花粉萌发率。
1.3数据分析
采用DPS软件对试验数据进行最小差异法（LSD）分析（P<0.05）。
2结果与分析
2.1培养温度对大喇叭杜鹃花粉萌发的影响
由图1-A可以看出，培养温度在5～15 ℃时，花粉萌发率几乎为0；当培养温度达到20 ℃时，花粉萌发数量急剧升高，萌发率达到48.9%；当培养温度在25 ℃时，花粉萌发率达到最大值，为87.0%；当培养温度进一步升高，花粉萌发率开始下降，30 ℃时的萌发率为60%，35 ℃时的萌发率下降到408%，而当培养温度高达40 ℃时，萌发率降为0。说明培养温度对大喇叭杜鹃花粉萌发的影响较大，最适培养温度为25 ℃。
2.2pH值对大喇叭杜鹃花粉萌发的影响
由图1-B可以看出，花粉在pH值为4.0～6.0的条件下能正常萌发，其萌发率在40%～87%之间；而当pH值为极酸的35和中性偏碱的6.5～7.5时，大喇叭杜鹃花粉均不会萌发，其萌发率为0；当pH值在4.0～5.5时，大喇叭杜鹃花粉的萌发率均能达到69%以上，且当pH值为4.5时，其花粉萌发率达到最大值，为87%。说明大喇叭杜鹃花粉对pH值较为敏感，在过度偏酸和中性偏碱的培养件条件下，其花粉均不能萌发。 2.3贮藏方式对大喇叭杜鹃花粉萌发的影响
贮藏前的大喇叭杜鹃花粉有较高的生命力，其花粉萌发率达91.7%，适宜授粉。从表1可以看出，在室温、4 ℃、-18 ℃ 等3种贮藏条件下，随着贮藏时间的延长，大喇叭杜鹃花粉的萌发率均降低，并且以室温条件下的花粉萌发率下降得最快。室温贮藏1个月后，花粉萌发率降低至581%，贮藏2个月后为37.6%，4个月后其花粉萌发率已降为46%，6个月时已降为0；4 ℃条件下，其花粉萌发率的降低速度相对缓慢，贮藏2个月后的花粉萌发率为68.7%，贮藏4、5个月后的花粉萌发率分别为12.2%、21.3%，而6个月后则降至1.4%；-18 ℃下的花粉贮藏效果最好，贮藏1个月后的花粉萌发率与新鲜花粉相当，达90.1%，至4个月时其萌发率依然大于60.0%，贮藏5、6个月后的花粉萌发率分别为47.3%、15.0%。
3结论与讨论
花粉是植物有性繁殖进行遗传物质传递的载体，其活力直接影响传递的成败。因此在进行授粉之前，首先要对花粉的活力进行检测。花粉的生活力因品种而异，并且随着外界的影响（温度、湿度、辐射、贮藏条件）而变化。Wolukau等认为，梅花花粉的最佳培养温度为25 ℃[9]；Burke等认为，棉花花粉的适宜的培养温度为20～37 ℃[10]。本试验结果表明，培养温度对大喇叭杜鹃花粉的萌发生长有明显影响，其花粉萌发的最适培养温度为25 ℃，过高的培养温度则会抑制花粉萌发。
本试验结果还表明，在pH值为4.0～6.0的条件下，大喇叭杜鹃花粉能正常萌发生长，且萌发率达到40%以上，最大萌发率为87%，当pH值在3.5或6.0～7.5时，花粉就不能萌发，最适合大喇叭杜鹃花粉萌发的pH值为4.5。这与苹果属花粉、甜橙花粉等极不相同，苹果属、甜橙等植物的花粉在pH值为4.0～9.0之间都能够正常萌发，甜橙花粉最适的pH值为6.0～7.0[11]；而七子花在pH值为5.5～8.0条件下均能萌发，最适 pH值为7，强酸或强碱条件均不利于大部分植物离体花粉的萌发与生长[12]。本研究发现，大喇叭杜鹃的花粉在强酸下最适合萌发，这与其实际的生长环境极其相关。
影响花粉寿命的关键因素是花粉含水量和贮藏温度，低温、干燥处理是长期保存花粉的必要条件[13-15]。有研究表明，将不同品种的飞燕草花粉干燥并贮藏在-30 ℃条件下，经过180 d后仍然保持较高的萌发率和较长的花粉管[16]。本试验结果表明，随着贮藏时间的延长，大喇叭杜鹃花粉的萌发率逐渐下降；适当的低温贮藏有利于延长大喇叭杜鹃花粉的寿命，贮藏在-18 ℃下的花粉经过1个月后仍然保持90.1%的萌发率，与贮藏前花粉的萌发率（91.7%）相比仅仅下降了1.6百分点。总体看来，低温保存是目前植物种质资源保存中较理想的途径，低温贮藏的大喇叭杜鹃花粉可直接用于杂交育种中进行授粉，从而为进一步培育新品种奠定了坚实的基础，也为将来用超低温保存技术对其长期保存作了基础性的技术保障。
参考文献：
[1]冯国楣. 云南杜鹃花[M]. 昆明：云南人民出版社，1983.
[2]胡琳貞，方明渊. 中国植物志：第五十七卷第二分册[M]. 北京：科学出版社，1994.
[3]中国科学院昆明植物研究所. 云南植物志：第四卷（种子植物）[M]. 北京：科学出版社，1986：58-99.
[4]张长芹. 杜鹃花[M]. 北京：中国建筑工业出版社，2003：188.
[5]冯国楣. 中国杜鹃花：第2册[M]. 北京：科学出版社，1992：117.
[6]Messerli M A，Robinson K R. Ionic and osmotic disruptions of the lily pollen tube oscillator：testing proposed models[J]. Planta，2003，217（1）：147-157.
[7]Shivanna K R. Pollen biology and biotechnology[M]. USA：Science Publishers，2003：61-67.
[8]Holdaway-Clarke T L，Weddle N M，Kim S，et al. Effect of extracellular calcium，pH value and borate on growth oscillations in Lilium formosanum pollen tubes[J]. Journal of Experimental Botany，2003，54（380）：65-72.
[9]Wolukau J N，Zhang S L，Xu G H，et al. The effect of temperature，polyamines and polyamine synthesis inhibitor on in vitro pollen germination and pollen tube growth of Prunus mume[J]. Scientia Horticulturae，2004，99（3/4）：289-299.
[10]Burke J J，Velten J，Oliver M J. In vitro analysis of cotton pollen germination[J]. Agronomy Journal，2004，96（2）：359-368.
[11]吴琼，曹立，张弛，等. pH值对甜橙花粉萌发及花粉管Ca2+分布的影响[J]. 山西农业大学学报：自然科学版，2012，32（4）：337-340.
[12]何琪，何芳，刘鹏，等. PEG-4000、蔗糖及pH值对七子花花粉萌发的影响[J]. 湖北农业科学，2006，45（2）：214-216.
[13]Barnabas B，Rajki E. Storage of maize（Zea mays L.） pollen at -196 ℃ in liquid nitrogen[J]. Euphytica，1976，25（1）：747-752.
[14]Barnabas B，Kovacs G，Abranyi A，et al. Effect of pollen storage by drying and deep-freezing on the expression of different agronomic traits in maize（Zea mays L.）[J]. Euphytica，1988，39（3）：221-225.
[15]王彩虹，田义轲. 果树花粉保存研究进展[J]. 落叶果树，1996（增刊1）：35-36，39.
[16]Honda K，Watanabe H，Tsutsui K. Cryopreservation of Delphinium pollen at -30 ℃[J]. Euphytica，2002，126（3）：315-320.
关键词：大喇叭杜鹃；花粉萌发；温度；pH值；贮藏
中图分类号： S685.210.1 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）07-0186-02
收稿日期：2013-10-22
基金项目：云南省科技计划（编号：2011EB110）。
作者简介：陆琳（1976—），女，云南昆明人，高级实验师，主要从事云南特色园林花卉的种质资源创新研究。Tel：（0871）65892602；E-mail：Lu_lin2005@sina.com。
通信作者：李树发，男，硕士，研究员，主要从事云南特色花卉新品种选育及产业化开发应用研究。Tel：（0871）65892602；E-mail：lsf206498@126.com。云南省是杜鹃花的世界分布中心之一，有着丰富的种质资源[1-3]。大喇叭杜鹃（Rhododendron excellens Hemsl.et Wils.）为杜鹃花科杜鹃花属常绿灌木，主要分布在云南省内，且分布范围较小而集中，大部分分布于滇东南地区的文山州境内，在玉溪和红河以及临沧也有少量分布。大喇叭杜鹃花大而密集，花形独特，具有较高的观赏价值，是培育高山杜鹃大花品种的优良亲本资源[4-5]。花粉活力直接与育种效率有关，而杜鹃花花粉活力及其贮藏方法的研究是开展高山杜鹃良种培育的前提。经研究发现，不同植物的花粉萌发条件不尽相同[6]，如苹果属（Malus）植物花粉在pH值 4.0～9.0之间都能正常萌发[7]；Holdaway-Clarke 等研究发现，台湾百合花粉的萌发与生长都会受外源pH值变化的影响[8]。目前国内外尚无大喇叭杜鹃花粉的萌发条件及贮藏方法的相关报道。本研究通过对大喇叭杜鹃花粉的萌发温度、pH值、贮藏温度及其贮藏时间进行研究，拟探讨大喇叭杜鹃花粉萌发所需的条件，了解其花粉的贮藏耐性，旨在解决花期不遇、异地授粉等杂交中的实际困难，为高山杜鹃的杂交育种提供科学依据和技术指导。
1材料与方法
1.1试验材料
試验在云南省农业科学院花卉研究所的实验室内进行，试验材料大喇叭杜鹃花粉采自云南省麻栗坡县下金厂乡干坝子，地理位置23°07′27.58″N、104°49′21.70″E，海拔1 858～1 891 m。
1.2试验方法
1.2.1花粉粒的收集于散粉前采集大喇叭杜鹃的花药，采用阴干法置于硅胶中干燥24～48 h，见花粉粒分离开时采集花粉。
1.2.2花粉生活力的测定采用花粉离体萌发法测定花粉的生活力，离体培养法的培养基配方为50 g/L蔗糖+50 mg/L硼酸+50 mg/L氯化钙+0.7%琼脂。用玻璃棒加1～2滴培养液于载玻片上，稍冷却后用干净的毛笔蘸取少许花粉均匀撒播于培养基表面，置于25 ℃恒温培养箱中，黑暗条件下培养6 h后观察花粉萌发情况。每个处理设4次重复（即培养4个载玻片），每个重复选取2个随机视野（本试验采用200倍视野），每个视野中应不少于50粒花粉，记录发芽率，相关计算公式如下。
发芽率=视野内已发芽的花粉数/视野内的花粉粒总数×100%。
1.2.3不同温度条件对花粉萌发率的影响在5、10、15、20、25、30、35、40 ℃条件下培养大喇叭杜鹃花粉。6 h后在显微镜下观察并统计花粉萌发率，比较不同温度条件下花粉萌发率的差异。
1.2.4外源pH值梯度的设定采用花粉培养基（测定pH值为5.6），用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl对培养基的pH值进行梯度调节，分别设pH值为3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、60、6.5、7.0、7.5。
1.2.5不同贮藏条件及不同贮藏时间下花粉萌发力的测定将干燥后的花粉分别装入45个1.5 mL的离心管中，每个处理设3次重复。为了避免湿度的影响，在离心管中预先铺1层扇形的吸水纸，并采用以下3种方法密封保存大喇叭杜鹃花粉：常温保存、4 ℃冰箱保存、-18 ℃冰箱保存。从花粉贮藏起开始，每隔一定时间（1、2、4、5、6个月）定期检测花粉萌发率。
1.3数据分析
采用DPS软件对试验数据进行最小差异法（LSD）分析（P<0.05）。
2结果与分析
2.1培养温度对大喇叭杜鹃花粉萌发的影响
由图1-A可以看出，培养温度在5～15 ℃时，花粉萌发率几乎为0；当培养温度达到20 ℃时，花粉萌发数量急剧升高，萌发率达到48.9%；当培养温度在25 ℃时，花粉萌发率达到最大值，为87.0%；当培养温度进一步升高，花粉萌发率开始下降，30 ℃时的萌发率为60%，35 ℃时的萌发率下降到408%，而当培养温度高达40 ℃时，萌发率降为0。说明培养温度对大喇叭杜鹃花粉萌发的影响较大，最适培养温度为25 ℃。
2.2pH值对大喇叭杜鹃花粉萌发的影响
由图1-B可以看出，花粉在pH值为4.0～6.0的条件下能正常萌发，其萌发率在40%～87%之间；而当pH值为极酸的35和中性偏碱的6.5～7.5时，大喇叭杜鹃花粉均不会萌发，其萌发率为0；当pH值在4.0～5.5时，大喇叭杜鹃花粉的萌发率均能达到69%以上，且当pH值为4.5时，其花粉萌发率达到最大值，为87%。说明大喇叭杜鹃花粉对pH值较为敏感，在过度偏酸和中性偏碱的培养件条件下，其花粉均不能萌发。 2.3贮藏方式对大喇叭杜鹃花粉萌发的影响
贮藏前的大喇叭杜鹃花粉有较高的生命力，其花粉萌发率达91.7%，适宜授粉。从表1可以看出，在室温、4 ℃、-18 ℃ 等3种贮藏条件下，随着贮藏时间的延长，大喇叭杜鹃花粉的萌发率均降低，并且以室温条件下的花粉萌发率下降得最快。室温贮藏1个月后，花粉萌发率降低至581%，贮藏2个月后为37.6%，4个月后其花粉萌发率已降为46%，6个月时已降为0；4 ℃条件下，其花粉萌发率的降低速度相对缓慢，贮藏2个月后的花粉萌发率为68.7%，贮藏4、5个月后的花粉萌发率分别为12.2%、21.3%，而6个月后则降至1.4%；-18 ℃下的花粉贮藏效果最好，贮藏1个月后的花粉萌发率与新鲜花粉相当，达90.1%，至4个月时其萌发率依然大于60.0%，贮藏5、6个月后的花粉萌发率分别为47.3%、15.0%。
3结论与讨论
花粉是植物有性繁殖进行遗传物质传递的载体，其活力直接影响传递的成败。因此在进行授粉之前，首先要对花粉的活力进行检测。花粉的生活力因品种而异，并且随着外界的影响（温度、湿度、辐射、贮藏条件）而变化。Wolukau等认为，梅花花粉的最佳培养温度为25 ℃[9]；Burke等认为，棉花花粉的适宜的培养温度为20～37 ℃[10]。本试验结果表明，培养温度对大喇叭杜鹃花粉的萌发生长有明显影响，其花粉萌发的最适培养温度为25 ℃，过高的培养温度则会抑制花粉萌发。
本试验结果还表明，在pH值为4.0～6.0的条件下，大喇叭杜鹃花粉能正常萌发生长，且萌发率达到40%以上，最大萌发率为87%，当pH值在3.5或6.0～7.5时，花粉就不能萌发，最适合大喇叭杜鹃花粉萌发的pH值为4.5。这与苹果属花粉、甜橙花粉等极不相同，苹果属、甜橙等植物的花粉在pH值为4.0～9.0之间都能够正常萌发，甜橙花粉最适的pH值为6.0～7.0[11]；而七子花在pH值为5.5～8.0条件下均能萌发，最适 pH值为7，强酸或强碱条件均不利于大部分植物离体花粉的萌发与生长[12]。本研究发现，大喇叭杜鹃的花粉在强酸下最适合萌发，这与其实际的生长环境极其相关。
影响花粉寿命的关键因素是花粉含水量和贮藏温度，低温、干燥处理是长期保存花粉的必要条件[13-15]。有研究表明，将不同品种的飞燕草花粉干燥并贮藏在-30 ℃条件下，经过180 d后仍然保持较高的萌发率和较长的花粉管[16]。本试验结果表明，随着贮藏时间的延长，大喇叭杜鹃花粉的萌发率逐渐下降；适当的低温贮藏有利于延长大喇叭杜鹃花粉的寿命，贮藏在-18 ℃下的花粉经过1个月后仍然保持90.1%的萌发率，与贮藏前花粉的萌发率（91.7%）相比仅仅下降了1.6百分点。总体看来，低温保存是目前植物种质资源保存中较理想的途径，低温贮藏的大喇叭杜鹃花粉可直接用于杂交育种中进行授粉，从而为进一步培育新品种奠定了坚实的基础，也为将来用超低温保存技术对其长期保存作了基础性的技术保障。
参考文献：
[1]冯国楣. 云南杜鹃花[M]. 昆明：云南人民出版社，1983.
[2]胡琳貞，方明渊. 中国植物志：第五十七卷第二分册[M]. 北京：科学出版社，1994.
[3]中国科学院昆明植物研究所. 云南植物志：第四卷（种子植物）[M]. 北京：科学出版社，1986：58-99.
[4]张长芹. 杜鹃花[M]. 北京：中国建筑工业出版社，2003：188.
[5]冯国楣. 中国杜鹃花：第2册[M]. 北京：科学出版社，1992：117.
[6]Messerli M A，Robinson K R. Ionic and osmotic disruptions of the lily pollen tube oscillator：testing proposed models[J]. Planta，2003，217（1）：147-157.
[7]Shivanna K R. Pollen biology and biotechnology[M]. USA：Science Publishers，2003：61-67.
[8]Holdaway-Clarke T L，Weddle N M，Kim S，et al. Effect of extracellular calcium，pH value and borate on growth oscillations in Lilium formosanum pollen tubes[J]. Journal of Experimental Botany，2003，54（380）：65-72.
[9]Wolukau J N，Zhang S L，Xu G H，et al. The effect of temperature，polyamines and polyamine synthesis inhibitor on in vitro pollen germination and pollen tube growth of Prunus mume[J]. Scientia Horticulturae，2004，99（3/4）：289-299.
[10]Burke J J，Velten J，Oliver M J. In vitro analysis of cotton pollen germination[J]. Agronomy Journal，2004，96（2）：359-368.
[11]吴琼，曹立，张弛，等. pH值对甜橙花粉萌发及花粉管Ca2+分布的影响[J]. 山西农业大学学报：自然科学版，2012，32（4）：337-340.
[12]何琪，何芳，刘鹏，等. PEG-4000、蔗糖及pH值对七子花花粉萌发的影响[J]. 湖北农业科学，2006，45（2）：214-216.
[13]Barnabas B，Rajki E. Storage of maize（Zea mays L.） pollen at -196 ℃ in liquid nitrogen[J]. Euphytica，1976，25（1）：747-752.
[14]Barnabas B，Kovacs G，Abranyi A，et al. Effect of pollen storage by drying and deep-freezing on the expression of different agronomic traits in maize（Zea mays L.）[J]. Euphytica，1988，39（3）：221-225.
[15]王彩虹，田义轲. 果树花粉保存研究进展[J]. 落叶果树，1996（增刊1）：35-36，39.
[16]Honda K，Watanabe H，Tsutsui K. Cryopreservation of Delphinium pollen at -30 ℃[J]. Euphytica，2002，126（3）：315-320.