【摘 要】
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对已知的产气荚膜梭菌CPA编码基因进行优化设计,同时引入包括第56和130位的天冬氨酸（D）突变为甘氨酸（G）,及第275位的酪氨酸（Y）和第336位的天冬氨酸（D）突变为天冬酰胺（N）的4个氨基酸突变,经人工合成获得基因片段Gcpam4。将Gcpam4克隆至原核表达载体pET-30a（+）中进行表达与纯化,获得重组蛋白rCPAm4。利用Western blot方法检测rCPAm4与产气荚膜梭菌A
【基金项目】
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科技部十三五“牛羊重要疫病免疫防控新技术研究”重点专项子课题资助项目（2017WFD0500903）； 中国兽医药品监察所所级课题资助项目（201702）；
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对已知的产气荚膜梭菌CPA编码基因进行优化设计,同时引入包括第56和130位的天冬氨酸（D）突变为甘氨酸（G）,及第275位的酪氨酸（Y）和第336位的天冬氨酸（D）突变为天冬酰胺（N）的4个氨基酸突变,经人工合成获得基因片段Gcpam4。将Gcpam4克隆至原核表达载体pET-30a（+）中进行表达与纯化,获得重组蛋白rCPAm4。利用Western blot方法检测rCPAm4与产气荚膜梭菌A型毒素抗血清的反应性,并采用小鼠检测纯化蛋白的毒力。随后,将rCPAm4与Montanide ISA 201佐剂以1∶1的比例混合乳化制备疫苗,免疫家兔,按照《中华人民共和国兽药典》（2015年版）规定的方法检测兔血清的中和抗体效价。二免后21d,对家兔通过耳缘静脉注射1个家兔MLD剂量的A型产气荚膜梭菌毒素,以检测rCPAm4对家兔的免疫保护效果。结果表明,rCPAm4主要以包涵体的形式表达,且能与产气荚膜梭菌A型毒素抗血清反应;小鼠安全性试验显示,5.5mg/kg剂量的rCPAm4对小鼠仍无致死性;免疫rCPAm4后,每毫升的一免抗血清可中和10～20个小鼠MLD、二免抗血清可中和30～50个小鼠MLD的A型产气荚膜梭菌毒素;1个家兔MLD的A型产气荚膜梭菌毒素攻毒后,对照组家兔100%死亡,免疫组家兔得到了100%的保护。以上结果表明,rCPAm4具有良好的安全性和免疫原性,从而为A型产气荚膜梭菌基因工程亚单位疫苗的研制提供了重要的试验数据。
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