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【摘要】 目的：制备一种适用于荧光POCT仪器光路校准的荧光微球校准卡。方法：通过偶联羧基荧光素和氨基聚苯乙烯微球制备荧光微球校准卡，在荧光POCT仪器上进行光路校准应用。结果：制备的荧光微球校准卡精密度CV<4%，测值重复性CV<10%，具备较好的检测性能;在避光、常温和干燥的环境中，保存期限≥1年;应用在荧光POCT仪器光路校准的相对偏差<4%，满足校准要求。结论：制备了一种稳定性好、时效性长、便携的荧光微球校准卡。
【关键词】 荧光POCT仪器;荧光微球校准卡;稳定性;光路校准
【DOI编码】 10.3969/j.issn.1674-4977.2021.06.025
Preparation and Application of Fluorescence Microsphere
Calibration Card
WANG Lu-hai，WANG Zheng，HU Wei
（Getein Biotech，Inc.，Nanjing 210000，China）
Abstract： Abstract：To prepare a fluorescence microsphere calibration card suitable for optical path calibration of fluorescence POCT instrument. Methods： The calibration card of fluorescence microsphere was prepared by coupling carboxycellulose and amino polystyrene for precision. Results：The fluorescent microsphere calibration card precision is CV<4% and repeated CV<10%，with good detection performance;suitable for preservation in light avoidance，normal temperature and dry environment and ≥1 year;the relative deviation of optical path calibration of fluorescent POCT instrument <4%，meeting the calibration requirements. Conclusion：It prepared a good stability，long timeliness and portable accurate，simple and fast calibration of fluorescent POCT instrument.
Key words： fluorescent POCT instrument;fluorescent microsphere calibration card;stability;optical and road calibration
1 引言
荧光POCT仪器是常用于家庭健康监测[1]和急诊抢救[2]的一款快速检测仪器，其检测准确性具有重要意义，但不同厂家仪器光路结构、组件型号、装配工艺等差异都会影响仪器检测的客观性，必须对其进行校准以期符合临床检测水平。此外，目前企业常用的光路校准方法为滴加试剂条，存在展板时间长、测值时效短等问题，不利于企业量产仪器和市场仪器的校准与维护。而荧光微球[3]是能激发高强度、稳定荧光的材料[4-5]，在生命科学与医学领域应用广泛[6]。因此，本研究制备了一种适用于荧光POCT仪器光路校准的荧光微球校准卡，用于仪器的准确、简便、快速校准。
2 材料与方法
2.1 材料与设备
10%氨基聚苯乙烯微球（东莞汉诺生物），蔗糖、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、EDC（1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐）等（阿拉丁试剂）、635 nm羧基荧光素、硝酸纤维素膜（NC膜）、干燥剂等（基蛋生物）。
加热磁力搅拌器（济南来宝医疗），HGS101全自动划膜仪（杭州峰航科技），Getein 1600全自动荧光免疫定量分析仪（基蛋生物），电热恒温鼓风干燥箱（南京五和试验设备）。
2.2 实验方法
2.2.1 荧光微球校准卡的制备
在50 mL圆底烧瓶中倒入30 mL 20 mM PB缓冲液（pH 7.4），依次加入5 mL 10%氨基微球和10 mg羧化荧光素，30 [℃]搅拌反应30 min，再加入50 mg EDC，继续搅拌反应1 h。反应结束后离心清洗3遍，纯化水复溶得到荧光微球溶液。用含1%蔗糖的PBS依次稀释荧光微球溶液至20倍、40倍、80倍、2000倍，使用全自动划膜仪喷膜划线，C线为稀释40倍的荧光微球溶液，T线分别为稀释20倍、80倍、2000倍的熒光微球溶液，干燥后切割成长条，干燥、避光保存。
2.2.2 校准卡性能评价
1）精密度
从同一批次分别挑选低、中、高荧光微球校准卡各20个，在Getein 1600荧光免疫定量分析仪（以下简称：仪器）测定电压值，计算其均值及变异系数（CV，%），以此作为批内和批次精密度。要求精密度CV≤10%。
2）重复性
从同一批次中随机挑选低、中、高校准卡各6个，连续测值20次，计算变异系数（CV，%），要求不超过10%。
3）稳定性影响因素
①光照的影响
随机挑选低、中、高校准卡各3个，保存至含有干燥剂的透明袋中，放置在室温（25 [℃]）下，每3天测定电压，平行测定3次。设置保存在锡箔密封袋中的校准卡作对照组，记录测定数据，计算相对偏差。 ②温度的影响
操作同步骤a，温度条件设置为低温（4 [℃]）和高温（45 [℃]），室温（25 [℃]）结果作为对照，计算相对偏差。
③湿度的影响
操作同步骤①，湿度条件为高湿（60%～80%），干燥结果做对照，计算相对偏差。
④保存期限的确定
随机挑选低、中、高三种校准卡各5个，每隔45天测定电压，平行测定3次，计算变异系数（CV，%），要求不超过5%，以此确定保存期限。
⑤线性相关性
按等比例稀释高值浓度的荧光微球溶液至4860倍，制备6个梯度校准卡。以5次重复检测电压值的平均值（Yi）为因变量，以稀释倍数（Xi）的倒数作为自变量，求出线性回归方程，计算线性相关系数R，要求R≥0.95。
2.2.3 光路校准应用
采用5套低、中、高值荧光微球校准卡分别在标准机和5台待测机测试电压，平行测定3次，以标准机检测电压的平均值作为靶值，与待测机电压平均值拟合曲线，自动计算校准系数，完成光路校准。然后用校准品复测标准机和待测机，计算相对偏差，要求不超过4%。
3 結果
3.1 精密度
对同批次和不同批次制备的荧光微球校准卡进行精密度检测，结果如表1所示。同一批次和不同批次制备的低、中、高三种电压值的荧光微球校准卡C.V均小于4%，满足制备校准卡精密度小于10%的要求，表明使用该方法制备的荧光微球校准卡精密度较好。
3.2 重复性
结果如表2所示，低、中、高三种荧光微球校准卡的重复性检测CV均小于10%，满足检测要求。其中，中、高值的重复性CV相较于低值偏小，分析原因是荧光微球校准卡存在少量荧光猝灭现象，随着仪器激发光源的照射，校准卡发射荧光的强度会慢慢减弱，而低值电压基数过小，导致通过计算得到CV相较于中、高值偏大，但仍在可接受范围内。
3.3 稳定性
3.3.1 稳定性影响因素
将校准卡分别在光照、高温、低温和高湿等储存环境下连续测值，结果如表3所示。由于光线中含有能使荧光猝灭的光谱波段，长期暴露会导致荧光强度降低，校准卡在暴露光线5天后实验组测值偏差相较于对照组降低约20%～40%，30天后约降低40%～60%;低温和高湿的储存环境对低电压值的校准卡测值影响较大，分别在储存20天和30天后测值偏差超过10%，说明低值校准卡在这两种环境下稳定性较差，不符合存储要求;而校准卡在45[℃]的高温环境下存储较稳定，存放1月后的测值偏差仍与对照组接近，具备较好的高温存储性能。考虑到存储的环保性与便捷性，荧光微球校准卡最适合保存在避光、常温和干燥的环境中，即选择含干燥剂的锡箔袋密封包装，常温放置。
3.3.2 保存期限
表3结果表明，随着保存天数的增加，荧光微球校准卡的CV逐渐增大，是由于激光照射下发生少量的荧光猝灭，而保存360天的校准卡电压CV仍在5%以内，满足其使用要求，说明该校准卡的存储稳定性较好，在常温、干燥、避光环境下可至少保存一年。
3.3.3 线性相关性
以荧光微球20倍稀释液为初始液，按3倍的比例依次稀释至4860倍，以稀释倍数的倒数为横坐标（Xi）、检测电压值（Yi）为纵坐标，建立线性回归曲线，如图1所示，线性方程y=12648x+61.11显示在稀释浓度20～4860倍内呈良好线性，线性相关系数R2=0.9999，检测平均值与估算值的相对偏差均<±5%，呈现较好的线性。
3.3.4 光路校准应用
表5结果表明，使用荧光微球校准卡校准光路后，标准机与待测机的相对偏差从最初的60%～200%全部降低至3%以内，满足仪器光路检测相对偏差在4%以内的要求，且待测值与靶值的线性相关性≥0.9999，具备较高的校准可行性。
4 结论
本研究通过偶联羧基荧光素和氨基聚苯乙烯微球制备了一种稳定性好、时效性长、便携的荧光微球校准卡，消除了各厂家仪器间测值差异，实现了各仪器检测结果的可比性，提高和保证了仪器检测结果的准确性;而且该校准卡具有存储环境简单、存储期限长、携带方便、脱离试剂可直接上机检测等优势，为企业制造的和市场上大量使用的荧光POCT仪器光路校准提供简便性、快速性，为其检测结果的准确性、稳定性和可比性提供良好的保障，为企业校准荧光POCT出厂仪器和规范荧光POCT市场仪器提供了有力的技术支持，具有广阔的应用前景。
【参考文献】
[1] 孙小莉，汤晓阳，郭艳，等.POCT（即时检验）在提升社区卫生服务中心健康服务能力方面的探讨[J].中国医疗器械信息，2019（17）：40-41.
[2] 段小勇，王晟，吴柳春.POCT在急诊医学中的应用与管理[J].检验医学与临床，2020（17）：2582-2585.
[3] Burns Andrew，Ow Hooisweng，Wiesner Ulrich.Fluorescent core-shell silica nanoparticles：towards“Lab on a Particle”architectures for nanobiotechnology.[J].Chemical Society reviews，2006（11）.
[4] 徐玉良.自发荧光聚苯乙烯微球的制备、表征及应用[D].青岛：中国石油大学（华东），2017.
[5] 汪地强，刘白玲，胡杰，等.荧光微球的制备及应用[J].高分子材料科学与工程，2004（4）：42-45.
【作者简介】
王路海，男，1984年出生，工程师，学士，研究方向为产品质量控制与质量管理。
【关键词】 荧光POCT仪器;荧光微球校准卡;稳定性;光路校准
【DOI编码】 10.3969/j.issn.1674-4977.2021.06.025
Preparation and Application of Fluorescence Microsphere
Calibration Card
WANG Lu-hai，WANG Zheng，HU Wei
（Getein Biotech，Inc.，Nanjing 210000，China）
Abstract： Abstract：To prepare a fluorescence microsphere calibration card suitable for optical path calibration of fluorescence POCT instrument. Methods： The calibration card of fluorescence microsphere was prepared by coupling carboxycellulose and amino polystyrene for precision. Results：The fluorescent microsphere calibration card precision is CV<4% and repeated CV<10%，with good detection performance;suitable for preservation in light avoidance，normal temperature and dry environment and ≥1 year;the relative deviation of optical path calibration of fluorescent POCT instrument <4%，meeting the calibration requirements. Conclusion：It prepared a good stability，long timeliness and portable accurate，simple and fast calibration of fluorescent POCT instrument.
Key words： fluorescent POCT instrument;fluorescent microsphere calibration card;stability;optical and road calibration
1 引言
荧光POCT仪器是常用于家庭健康监测[1]和急诊抢救[2]的一款快速检测仪器，其检测准确性具有重要意义，但不同厂家仪器光路结构、组件型号、装配工艺等差异都会影响仪器检测的客观性，必须对其进行校准以期符合临床检测水平。此外，目前企业常用的光路校准方法为滴加试剂条，存在展板时间长、测值时效短等问题，不利于企业量产仪器和市场仪器的校准与维护。而荧光微球[3]是能激发高强度、稳定荧光的材料[4-5]，在生命科学与医学领域应用广泛[6]。因此，本研究制备了一种适用于荧光POCT仪器光路校准的荧光微球校准卡，用于仪器的准确、简便、快速校准。
2 材料与方法
2.1 材料与设备
10%氨基聚苯乙烯微球（东莞汉诺生物），蔗糖、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、EDC（1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐）等（阿拉丁试剂）、635 nm羧基荧光素、硝酸纤维素膜（NC膜）、干燥剂等（基蛋生物）。
加热磁力搅拌器（济南来宝医疗），HGS101全自动划膜仪（杭州峰航科技），Getein 1600全自动荧光免疫定量分析仪（基蛋生物），电热恒温鼓风干燥箱（南京五和试验设备）。
2.2 实验方法
2.2.1 荧光微球校准卡的制备
在50 mL圆底烧瓶中倒入30 mL 20 mM PB缓冲液（pH 7.4），依次加入5 mL 10%氨基微球和10 mg羧化荧光素，30 [℃]搅拌反应30 min，再加入50 mg EDC，继续搅拌反应1 h。反应结束后离心清洗3遍，纯化水复溶得到荧光微球溶液。用含1%蔗糖的PBS依次稀释荧光微球溶液至20倍、40倍、80倍、2000倍，使用全自动划膜仪喷膜划线，C线为稀释40倍的荧光微球溶液，T线分别为稀释20倍、80倍、2000倍的熒光微球溶液，干燥后切割成长条，干燥、避光保存。
2.2.2 校准卡性能评价
1）精密度
从同一批次分别挑选低、中、高荧光微球校准卡各20个，在Getein 1600荧光免疫定量分析仪（以下简称：仪器）测定电压值，计算其均值及变异系数（CV，%），以此作为批内和批次精密度。要求精密度CV≤10%。
2）重复性
从同一批次中随机挑选低、中、高校准卡各6个，连续测值20次，计算变异系数（CV，%），要求不超过10%。
3）稳定性影响因素
①光照的影响
随机挑选低、中、高校准卡各3个，保存至含有干燥剂的透明袋中，放置在室温（25 [℃]）下，每3天测定电压，平行测定3次。设置保存在锡箔密封袋中的校准卡作对照组，记录测定数据，计算相对偏差。 ②温度的影响
操作同步骤a，温度条件设置为低温（4 [℃]）和高温（45 [℃]），室温（25 [℃]）结果作为对照，计算相对偏差。
③湿度的影响
操作同步骤①，湿度条件为高湿（60%～80%），干燥结果做对照，计算相对偏差。
④保存期限的确定
随机挑选低、中、高三种校准卡各5个，每隔45天测定电压，平行测定3次，计算变异系数（CV，%），要求不超过5%，以此确定保存期限。
⑤线性相关性
按等比例稀释高值浓度的荧光微球溶液至4860倍，制备6个梯度校准卡。以5次重复检测电压值的平均值（Yi）为因变量，以稀释倍数（Xi）的倒数作为自变量，求出线性回归方程，计算线性相关系数R，要求R≥0.95。
2.2.3 光路校准应用
采用5套低、中、高值荧光微球校准卡分别在标准机和5台待测机测试电压，平行测定3次，以标准机检测电压的平均值作为靶值，与待测机电压平均值拟合曲线，自动计算校准系数，完成光路校准。然后用校准品复测标准机和待测机，计算相对偏差，要求不超过4%。
3 結果
3.1 精密度
对同批次和不同批次制备的荧光微球校准卡进行精密度检测，结果如表1所示。同一批次和不同批次制备的低、中、高三种电压值的荧光微球校准卡C.V均小于4%，满足制备校准卡精密度小于10%的要求，表明使用该方法制备的荧光微球校准卡精密度较好。
3.2 重复性
结果如表2所示，低、中、高三种荧光微球校准卡的重复性检测CV均小于10%，满足检测要求。其中，中、高值的重复性CV相较于低值偏小，分析原因是荧光微球校准卡存在少量荧光猝灭现象，随着仪器激发光源的照射，校准卡发射荧光的强度会慢慢减弱，而低值电压基数过小，导致通过计算得到CV相较于中、高值偏大，但仍在可接受范围内。
3.3 稳定性
3.3.1 稳定性影响因素
将校准卡分别在光照、高温、低温和高湿等储存环境下连续测值，结果如表3所示。由于光线中含有能使荧光猝灭的光谱波段，长期暴露会导致荧光强度降低，校准卡在暴露光线5天后实验组测值偏差相较于对照组降低约20%～40%，30天后约降低40%～60%;低温和高湿的储存环境对低电压值的校准卡测值影响较大，分别在储存20天和30天后测值偏差超过10%，说明低值校准卡在这两种环境下稳定性较差，不符合存储要求;而校准卡在45[℃]的高温环境下存储较稳定，存放1月后的测值偏差仍与对照组接近，具备较好的高温存储性能。考虑到存储的环保性与便捷性，荧光微球校准卡最适合保存在避光、常温和干燥的环境中，即选择含干燥剂的锡箔袋密封包装，常温放置。
3.3.2 保存期限
表3结果表明，随着保存天数的增加，荧光微球校准卡的CV逐渐增大，是由于激光照射下发生少量的荧光猝灭，而保存360天的校准卡电压CV仍在5%以内，满足其使用要求，说明该校准卡的存储稳定性较好，在常温、干燥、避光环境下可至少保存一年。
3.3.3 线性相关性
以荧光微球20倍稀释液为初始液，按3倍的比例依次稀释至4860倍，以稀释倍数的倒数为横坐标（Xi）、检测电压值（Yi）为纵坐标，建立线性回归曲线，如图1所示，线性方程y=12648x+61.11显示在稀释浓度20～4860倍内呈良好线性，线性相关系数R2=0.9999，检测平均值与估算值的相对偏差均<±5%，呈现较好的线性。
3.3.4 光路校准应用
表5结果表明，使用荧光微球校准卡校准光路后，标准机与待测机的相对偏差从最初的60%～200%全部降低至3%以内，满足仪器光路检测相对偏差在4%以内的要求，且待测值与靶值的线性相关性≥0.9999，具备较高的校准可行性。
4 结论
本研究通过偶联羧基荧光素和氨基聚苯乙烯微球制备了一种稳定性好、时效性长、便携的荧光微球校准卡，消除了各厂家仪器间测值差异，实现了各仪器检测结果的可比性，提高和保证了仪器检测结果的准确性;而且该校准卡具有存储环境简单、存储期限长、携带方便、脱离试剂可直接上机检测等优势，为企业制造的和市场上大量使用的荧光POCT仪器光路校准提供简便性、快速性，为其检测结果的准确性、稳定性和可比性提供良好的保障，为企业校准荧光POCT出厂仪器和规范荧光POCT市场仪器提供了有力的技术支持，具有广阔的应用前景。
【参考文献】
[1] 孙小莉，汤晓阳，郭艳，等.POCT（即时检验）在提升社区卫生服务中心健康服务能力方面的探讨[J].中国医疗器械信息，2019（17）：40-41.
[2] 段小勇，王晟，吴柳春.POCT在急诊医学中的应用与管理[J].检验医学与临床，2020（17）：2582-2585.
[3] Burns Andrew，Ow Hooisweng，Wiesner Ulrich.Fluorescent core-shell silica nanoparticles：towards“Lab on a Particle”architectures for nanobiotechnology.[J].Chemical Society reviews，2006（11）.
[4] 徐玉良.自发荧光聚苯乙烯微球的制备、表征及应用[D].青岛：中国石油大学（华东），2017.
[5] 汪地强，刘白玲，胡杰，等.荧光微球的制备及应用[J].高分子材料科学与工程，2004（4）：42-45.
【作者简介】
王路海，男，1984年出生，工程师，学士，研究方向为产品质量控制与质量管理。