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摘 要：【目的】探明印染废水生物反应器中活的非可培养（viable but non-culturable，VBNC）细菌及其系统关系。【方法】利用土质滤材构建生物反应器，基于复苏促进因子（resuscitation promoting factor，Rpf） 对VBNC细菌的复苏刺激生长作用，采用最大可能数法（most probable number，MPN）及其MPN培养系判断样品中的细菌总数，稀释平板法分离其中复苏可培养化的VBNC菌株，解析16S rRNA基因系统关系。【结果】（1）MPN培养系中，处理组MPN值对应的细菌总数为9.3×106～2.4×108，大于对照组MPN值对应的细菌总数4.3×106～9.3×106，表明添加Rpf后可培养化细菌总数最高从每g样品的7.5×106提高到2.4×108；（2）添加Rpf可使样品中细菌分离丰度提高2.2～32倍，表明印染废水生物反应器中存在对Rpf敏感、复苏可培养化的VBNC优势菌群；（3）MPN培养系中处理组稀释段培养液的OD660值大于对照组的OD660值，表明Rpf对部分细菌菌种有生长刺激作用。【结论】利用复苏促进因子Rpf，探明了印染废水生物反应器中存在对Rpf敏感的VBNC菌种，包括放线菌、革兰氏阳性以及革兰氏阴性菌。本研究结果揭示了印染废水中存在大量活的但非可培养状态细菌，这将为其形成机理、复苏活性化机制以及印染废水深度处理工程工艺改进等方面的深入研究提供重要的思路与方法。
关键词：印染废水 生物反应器 VBNC菌 Rpf 16S rRNA基因序列系统关系
中图分类号：X703 文献标识码：A 文章编号：1674-098X（2014）07（b）-0103-02
全球每年都会排放大量的印染废水，因其成分复杂，碱度、有机物含量、色度以及化学需氧量高，生化降解性相对较低，排放量大、水质变动范围广，属难处理的工业废水。大量难降解染料的过量使用及排放已造成严重的环境污染，某些毒性物质对人类健康构成严重威胁，印染废水的深度处理已经引起社会广泛关注，而其中高效微生物处理技术的开发已经成为行业令人瞩目的研究热点。
利用传统的纯培养技术从土壤、活性污泥、海水、湖水、沉淀物以及城市污水处理系统等环境中能分离培养的微生物只占总数的0.01%～10%，其他的为未培养（uncultivated microorganisms） 或为活的但非可培养（viable but nonculturable， VBNC），表明多种生态环境中绝大部分微生物尚处于未知状态。
自从1982年Xu等人首次在环境中发现生存但不可培养的霍乱弧菌和大肠杆菌后，至今国内外已有大量文献报道了VBNC菌的相关内容。细菌由于多种因素导致进入VBNC状态，该类微生物在不良环境条件下具有生物活性，用常规培养法无法检出，但在一定条件下可以复苏并保存原有功能的一种特殊生理状态。尽管VBNC菌处于低代谢状态，但1998年Mukamolova等报道了藤黄微球菌 Micrococcus luteus在对数期后期分泌的一种蛋白质能使该菌以及近缘的分枝杆菌Mycobacterium属的一些处于VBNC状态的细胞复苏成为可培养化，这种蛋白质被命名为复苏促进因子Rpf（resuscitation promoting factor）。已有研究表明Rpf能复苏刺激大量革兰氏阳性菌的生长，包括Mycobacterium， Rhodococcus，Arthrobacter， Leifsonia，Bacillus， Nocardia， Kitasatospora，Streptomyces 和Paenibacillus属的细菌。丁等研究表明Rpf对难培养微好氧贫营养革兰氏阴性菌Curvibacter fontanus具有良好的促进生长的功能。
该文介绍利用复苏促进因子Rpf蛋白信号分子对VBNC细菌的复苏刺激生长作用，在设计的MPN培养系中，通过计数MPN值换算获得样品细菌总数，验证Rpf对VBNC菌种的复苏促进作用，从印染废水处理系统中分离处于VBNC状态菌群、解析其组成与16S rRNA基因系统进化关系。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 Rpf的制备
实验菌种藤黄微球菌Micrococcus luteus IAM 14879（=NCIMB 13267）由东京大学分子细胞生物学研究所国际菌种保藏中心提供。依据介绍的方法制备M. luteus的DNA，确定rpf基因引物进行PCR 扩增，利用pET15b质粒载体并转化大肠杆菌DE3 表达，以SDS-PAGE 检验获取纯化重组蛋白。rpf基因阳性菌（MpET15brpf-P）在LB培养基（Tryptone 10 g/L，Yeast extract 5 g/L， NaCl 10 g/L）、37 ℃、120/rpm条件下培养，以IPTG最佳条件诱导获得高表达Rpf蛋白，再以SDS-PAGE 检验确证标的蛋白。将培养液离心经0.22 μm膜过滤，保存在-20 ℃作为含Rpf的实验处理组添加材料。同时以rpf基因阴性菌（MpET15brpf-N）相同方法进行培养、离心和过滤的培养液作为不含Rpf的实验对照组添加材料。
1.1.2 样品及处理
利用特殊土质过滤材料构建连续流生物反应器。印染废水为浙江某印染废水处理厂经处理后的，经生物反应器（串联多塔式）连续流运行61 d、83 d和366 d，分别从生物反应器最初出水段三点取样共取3g土（折算为干重）至灭菌的100 mL锥形瓶中，加入27 mL灭菌蒸馏水搅拌20 min均匀做成悬液待用。实验重复三次。
1.1.3 培养基
MPN培养系中液体培养基组成：蛋白胨5.0 g，酵母膏0.5 g，葡萄糖5.0 vg，NaCl 2.5 g，苯乙醇（分析纯）3.0 mL，去离子水1000 mL，pH调至 7.0。稀释平板分离用固体培养基为加琼脂20.0 g /L。实验所用培养基均经121 ℃、15 min高压灭菌锅灭菌后使用。 1.1.4 主要试剂及仪器
SK1201-UNIQ-10柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒，UNIQ-10 DNA胶回收试剂盒，16S rRNA基因PCR扩增所用酶、引物和试剂均购于上海生工公司；PCR反应扩增仪（TP600日本Takara公司），凝胶成像系统（121409美国UVP公司），酶标仪（1510美国Thermo公司）。
1.2 方法
1.2.1 MPN法和MPN培养系
本实验利用MPN法和MPN培养系计数样品可培养细菌总数。以2.5～5 mL透明玻璃瓶作为培养容器，添加1%（v/v，用量确定实验数据未显示）含Rpf制备液至液体培养基中作为处理组，以添加等量不含Rpf制备液作为对照组，将以10%（v/v） 的样品悬液（在前项1.1.2所述），以十倍浓度梯度稀释到10-8，每组重复3次，30℃静置培养。根据培养时间测定处理组与对照组吸光值的变化（OD 660nm），并以OD660值以及肉眼判断，记录处理组与对照组培养液的混浊情况，浑浊为阳性，不浑浊为阴性。利用MPN表查出MPN值对应的处理组与对照组中的细菌总数。
1.2.2 Rpf复苏效果与VBNC状态菌的判断
本实验中以处理组与对照组MPN值分别对应的细菌总数之比作为Rpf复苏效果，基于Rpf效果确定复苏可培养化的VBNC以及促进生长作用的细菌。当复苏效果大于5（95%置信度），处理组的最前方某稀释段培养液浑浊（阳性），而对照组与之相同稀释段为不浑浊（阴性）时，处理组浑浊培养液经稀释平板分离，纯化所得的菌为单位样品中总数处于优势的VBNC状态菌。
1.2.3 菌株分离纯化与保存
经3～14 d静置培养并视MPN值趋于稳定情况，将处理组与对照组中最先端呈浑浊的培养液稀释，利用平板分离法筛选、纯化获得相应的可培养化的细菌菌种。将纯化的细菌扩大培养用于细菌鉴定，以及添加10%的甘油做成冷冻甘油管在-80 ℃保存。
2 结果
2.1 MPN培养系中MPN值与样品细菌总数
从印染废水连续流生物反应器中共取样3次，在MPN培养系中处理组与对照组的MPN值与每g样品中的细菌总数分别是2.4×107、2.4×108 、9.3×106和9.3×106、7.5×106 、4.3×106。表明基于添加Rpf后，从单位样品中检出的可培养细菌总数分别提高了62.0%、97.0%和54.0%，换言之，样品中至少分别有62.0%、97.0%和54.0%的细胞原来处于VBNC状态，表明利用一般培养基能被分离的细菌不到半数，甚至只有3%。证实印染废水生物反应器中存在一般培养基不能检出、添加Rpf后能复苏生长成为可培养化的VBNC状态细菌。
2.2 Rpf复苏效果及其培养液OD660值的变化
实验中我们定义了处理组可培养细菌总数除以对照组可培养细菌总数，表示Rpf复苏效果。实验结果看，不同运行时间段取样分析的Rpf复苏效果分别为2.6、32和2.2，表明印染废水生物反应器中，取样点单位样品中存在对Rpf敏感的VBNC优势菌群，同时量化的2.6、32和2.2为Rpf实际复苏效果。
2.3 分离菌株的16S rRNA基因序列同源性与系统树
分离纯化菌种经PCR扩增，扩增产物送上海生工生物有限公司测序，所得菌株16S rRNA基因序列结果在国际基因库DDBJ登录取得菌株登录号码。本实验研究分离的菌株为该基因库首次向世界公布的利用Rpf在MPN培养系中分离取得的VBNC菌。如YRJ6菌株的近缘菌种Moraxella osloensis，登录网址：http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AB847896/，/isolation_source =“printing and dyeing wastewater”。资料显示该菌种为从印染废水中基于Rpf和MPN培养系分离取得的VBNC菌。
3 讨论
本实验研究利用复苏促进因子Rpf，在MPN培养体系中，添加Rpf后单位样品中处理组比对照组检出的细菌总数增加了54.0%～97.0%，证实了印染废水中存在着大量处于VBNC状态的细菌。Rpf有效复苏效果为2.2～32，表明印染废水生物反应器中存在对Rpf敏感的VBNC优势菌群。处理组培养液的OD660值均大于对照组，表明Rpf对处理组中的细菌具有明显的生长刺激作用。通过稀释平板分离后，从处理组中分离到较多的菌株表现出更高的多样性，其中YDWLR1， YDWLR2， YDWLR6， YDWHR2， YDWLR5， YRJ1和YRJ6菌株，单位样品中可培养细菌总数达到106～108数量级，它们分别是Tepidimonas， Cupriavidus， Gordonia， Staphylococcus， Bucillus， Moraxella， Ochrobactrum和 Enhydrobacter属的近缘菌种，而在对照组培养液中，细菌总数106～108同等数量级中，则没有发现这些菌种。因而这些细菌可视为经Rpf复苏生长促进作用成为可培养化的VBNC细菌。实验结果发现Bucillus属的处于VBNC状态细菌在印染废水中出现概率较高，占分离菌株的48%。同时也发现了该属细菌中虽不处于VBNC状态，但Rpf对其具有明显的生长促进作用的菌种。
参考文献
[1] Colwell R， Brayton P， Grimes D， et al.Viable but non-culturable Vibrio cholerae and related pathogens in the environment： implications for release of genetically engineered microorganisms[J].Nature biotechnology，1985，3（9）：817-820.
[2] 丁林贤，苏晓梅，横田明.活的但非可培养（VBNC）状态菌的研究进展[J].微生物学报，2011，51（7）：858-862
[3] 丁林贤，张萍华，洪华嫦，等.2012.藤黄微球菌Rpf活性蛋白的制取及其对红球菌VBNC菌体的复苏作用[J]. 微生物学报，2012，52（1）：77-82
[4] Ding L（丁林贤），Yokota A. Curvibacter fontana sp. nov.， a microaerobic bacteria isolated from well water[J].The Journal of general and applied microbiology，2010，56（3）：267-271.
[5] Fegan N， Higgs G， Vanderlinde P， et al.Enumeration of Escherichia coli O157 in cattle faeces using most probable number technique and automated immunomagnetic separation[J]. Letters in applied microbiology， 2004，38（1）：56-59.
关键词：印染废水 生物反应器 VBNC菌 Rpf 16S rRNA基因序列系统关系
中图分类号：X703 文献标识码：A 文章编号：1674-098X（2014）07（b）-0103-02
全球每年都会排放大量的印染废水，因其成分复杂，碱度、有机物含量、色度以及化学需氧量高，生化降解性相对较低，排放量大、水质变动范围广，属难处理的工业废水。大量难降解染料的过量使用及排放已造成严重的环境污染，某些毒性物质对人类健康构成严重威胁，印染废水的深度处理已经引起社会广泛关注，而其中高效微生物处理技术的开发已经成为行业令人瞩目的研究热点。
利用传统的纯培养技术从土壤、活性污泥、海水、湖水、沉淀物以及城市污水处理系统等环境中能分离培养的微生物只占总数的0.01%～10%，其他的为未培养（uncultivated microorganisms） 或为活的但非可培养（viable but nonculturable， VBNC），表明多种生态环境中绝大部分微生物尚处于未知状态。
自从1982年Xu等人首次在环境中发现生存但不可培养的霍乱弧菌和大肠杆菌后，至今国内外已有大量文献报道了VBNC菌的相关内容。细菌由于多种因素导致进入VBNC状态，该类微生物在不良环境条件下具有生物活性，用常规培养法无法检出，但在一定条件下可以复苏并保存原有功能的一种特殊生理状态。尽管VBNC菌处于低代谢状态，但1998年Mukamolova等报道了藤黄微球菌 Micrococcus luteus在对数期后期分泌的一种蛋白质能使该菌以及近缘的分枝杆菌Mycobacterium属的一些处于VBNC状态的细胞复苏成为可培养化，这种蛋白质被命名为复苏促进因子Rpf（resuscitation promoting factor）。已有研究表明Rpf能复苏刺激大量革兰氏阳性菌的生长，包括Mycobacterium， Rhodococcus，Arthrobacter， Leifsonia，Bacillus， Nocardia， Kitasatospora，Streptomyces 和Paenibacillus属的细菌。丁等研究表明Rpf对难培养微好氧贫营养革兰氏阴性菌Curvibacter fontanus具有良好的促进生长的功能。
该文介绍利用复苏促进因子Rpf蛋白信号分子对VBNC细菌的复苏刺激生长作用，在设计的MPN培养系中，通过计数MPN值换算获得样品细菌总数，验证Rpf对VBNC菌种的复苏促进作用，从印染废水处理系统中分离处于VBNC状态菌群、解析其组成与16S rRNA基因系统进化关系。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 Rpf的制备
实验菌种藤黄微球菌Micrococcus luteus IAM 14879（=NCIMB 13267）由东京大学分子细胞生物学研究所国际菌种保藏中心提供。依据介绍的方法制备M. luteus的DNA，确定rpf基因引物进行PCR 扩增，利用pET15b质粒载体并转化大肠杆菌DE3 表达，以SDS-PAGE 检验获取纯化重组蛋白。rpf基因阳性菌（MpET15brpf-P）在LB培养基（Tryptone 10 g/L，Yeast extract 5 g/L， NaCl 10 g/L）、37 ℃、120/rpm条件下培养，以IPTG最佳条件诱导获得高表达Rpf蛋白，再以SDS-PAGE 检验确证标的蛋白。将培养液离心经0.22 μm膜过滤，保存在-20 ℃作为含Rpf的实验处理组添加材料。同时以rpf基因阴性菌（MpET15brpf-N）相同方法进行培养、离心和过滤的培养液作为不含Rpf的实验对照组添加材料。
1.1.2 样品及处理
利用特殊土质过滤材料构建连续流生物反应器。印染废水为浙江某印染废水处理厂经处理后的，经生物反应器（串联多塔式）连续流运行61 d、83 d和366 d，分别从生物反应器最初出水段三点取样共取3g土（折算为干重）至灭菌的100 mL锥形瓶中，加入27 mL灭菌蒸馏水搅拌20 min均匀做成悬液待用。实验重复三次。
1.1.3 培养基
MPN培养系中液体培养基组成：蛋白胨5.0 g，酵母膏0.5 g，葡萄糖5.0 vg，NaCl 2.5 g，苯乙醇（分析纯）3.0 mL，去离子水1000 mL，pH调至 7.0。稀释平板分离用固体培养基为加琼脂20.0 g /L。实验所用培养基均经121 ℃、15 min高压灭菌锅灭菌后使用。 1.1.4 主要试剂及仪器
SK1201-UNIQ-10柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒，UNIQ-10 DNA胶回收试剂盒，16S rRNA基因PCR扩增所用酶、引物和试剂均购于上海生工公司；PCR反应扩增仪（TP600日本Takara公司），凝胶成像系统（121409美国UVP公司），酶标仪（1510美国Thermo公司）。
1.2 方法
1.2.1 MPN法和MPN培养系
本实验利用MPN法和MPN培养系计数样品可培养细菌总数。以2.5～5 mL透明玻璃瓶作为培养容器，添加1%（v/v，用量确定实验数据未显示）含Rpf制备液至液体培养基中作为处理组，以添加等量不含Rpf制备液作为对照组，将以10%（v/v） 的样品悬液（在前项1.1.2所述），以十倍浓度梯度稀释到10-8，每组重复3次，30℃静置培养。根据培养时间测定处理组与对照组吸光值的变化（OD 660nm），并以OD660值以及肉眼判断，记录处理组与对照组培养液的混浊情况，浑浊为阳性，不浑浊为阴性。利用MPN表查出MPN值对应的处理组与对照组中的细菌总数。
1.2.2 Rpf复苏效果与VBNC状态菌的判断
本实验中以处理组与对照组MPN值分别对应的细菌总数之比作为Rpf复苏效果，基于Rpf效果确定复苏可培养化的VBNC以及促进生长作用的细菌。当复苏效果大于5（95%置信度），处理组的最前方某稀释段培养液浑浊（阳性），而对照组与之相同稀释段为不浑浊（阴性）时，处理组浑浊培养液经稀释平板分离，纯化所得的菌为单位样品中总数处于优势的VBNC状态菌。
1.2.3 菌株分离纯化与保存
经3～14 d静置培养并视MPN值趋于稳定情况，将处理组与对照组中最先端呈浑浊的培养液稀释，利用平板分离法筛选、纯化获得相应的可培养化的细菌菌种。将纯化的细菌扩大培养用于细菌鉴定，以及添加10%的甘油做成冷冻甘油管在-80 ℃保存。
2 结果
2.1 MPN培养系中MPN值与样品细菌总数
从印染废水连续流生物反应器中共取样3次，在MPN培养系中处理组与对照组的MPN值与每g样品中的细菌总数分别是2.4×107、2.4×108 、9.3×106和9.3×106、7.5×106 、4.3×106。表明基于添加Rpf后，从单位样品中检出的可培养细菌总数分别提高了62.0%、97.0%和54.0%，换言之，样品中至少分别有62.0%、97.0%和54.0%的细胞原来处于VBNC状态，表明利用一般培养基能被分离的细菌不到半数，甚至只有3%。证实印染废水生物反应器中存在一般培养基不能检出、添加Rpf后能复苏生长成为可培养化的VBNC状态细菌。
2.2 Rpf复苏效果及其培养液OD660值的变化
实验中我们定义了处理组可培养细菌总数除以对照组可培养细菌总数，表示Rpf复苏效果。实验结果看，不同运行时间段取样分析的Rpf复苏效果分别为2.6、32和2.2，表明印染废水生物反应器中，取样点单位样品中存在对Rpf敏感的VBNC优势菌群，同时量化的2.6、32和2.2为Rpf实际复苏效果。
2.3 分离菌株的16S rRNA基因序列同源性与系统树
分离纯化菌种经PCR扩增，扩增产物送上海生工生物有限公司测序，所得菌株16S rRNA基因序列结果在国际基因库DDBJ登录取得菌株登录号码。本实验研究分离的菌株为该基因库首次向世界公布的利用Rpf在MPN培养系中分离取得的VBNC菌。如YRJ6菌株的近缘菌种Moraxella osloensis，登录网址：http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AB847896/，/isolation_source =“printing and dyeing wastewater”。资料显示该菌种为从印染废水中基于Rpf和MPN培养系分离取得的VBNC菌。
3 讨论
本实验研究利用复苏促进因子Rpf，在MPN培养体系中，添加Rpf后单位样品中处理组比对照组检出的细菌总数增加了54.0%～97.0%，证实了印染废水中存在着大量处于VBNC状态的细菌。Rpf有效复苏效果为2.2～32，表明印染废水生物反应器中存在对Rpf敏感的VBNC优势菌群。处理组培养液的OD660值均大于对照组，表明Rpf对处理组中的细菌具有明显的生长刺激作用。通过稀释平板分离后，从处理组中分离到较多的菌株表现出更高的多样性，其中YDWLR1， YDWLR2， YDWLR6， YDWHR2， YDWLR5， YRJ1和YRJ6菌株，单位样品中可培养细菌总数达到106～108数量级，它们分别是Tepidimonas， Cupriavidus， Gordonia， Staphylococcus， Bucillus， Moraxella， Ochrobactrum和 Enhydrobacter属的近缘菌种，而在对照组培养液中，细菌总数106～108同等数量级中，则没有发现这些菌种。因而这些细菌可视为经Rpf复苏生长促进作用成为可培养化的VBNC细菌。实验结果发现Bucillus属的处于VBNC状态细菌在印染废水中出现概率较高，占分离菌株的48%。同时也发现了该属细菌中虽不处于VBNC状态，但Rpf对其具有明显的生长促进作用的菌种。
参考文献
[1] Colwell R， Brayton P， Grimes D， et al.Viable but non-culturable Vibrio cholerae and related pathogens in the environment： implications for release of genetically engineered microorganisms[J].Nature biotechnology，1985，3（9）：817-820.
[2] 丁林贤，苏晓梅，横田明.活的但非可培养（VBNC）状态菌的研究进展[J].微生物学报，2011，51（7）：858-862
[3] 丁林贤，张萍华，洪华嫦，等.2012.藤黄微球菌Rpf活性蛋白的制取及其对红球菌VBNC菌体的复苏作用[J]. 微生物学报，2012，52（1）：77-82
[4] Ding L（丁林贤），Yokota A. Curvibacter fontana sp. nov.， a microaerobic bacteria isolated from well water[J].The Journal of general and applied microbiology，2010，56（3）：267-271.
[5] Fegan N， Higgs G， Vanderlinde P， et al.Enumeration of Escherichia coli O157 in cattle faeces using most probable number technique and automated immunomagnetic separation[J]. Letters in applied microbiology， 2004，38（1）：56-59.