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摘要：目的 探讨5-Aza-dC及TSA对人胃癌细胞株SGC-7901 Runx3基因甲基化和表达水平的影响?方法 对5-Aza-dC及TSA单独或联合应用进行体外培养SGC-7901细胞的处理，分别提取细胞蛋白质?RNA和DNA，通过甲基化特异性定量PCR法进行Runx3基因启动子区甲基化状态进行检测?结果 对照组相对表达量与各组相对表达量相比具有明显的统计学差异（P<0.05），各组蛋白表达水平具有明显的统计学差异（P<0.05）?结论 5-Aza-dC和TSA两药联合应用具有一定的协调作用，进而改善胃癌治疗效果?
关键词：5-Aza-dC；人胃癌细胞株；SGC-7901 Runx3基因甲基化
【中图分类号】R735.2 【文献标识码】A 【文章编号】1672-8602（2015）04-0555-01
胃癌是一种发病率较高的恶性肿瘤，也是导致我国人民死亡的主要病因，该疾病在我国的死亡率和发病率均明显高出世界平均值?化疗药物治疗和手术治疗是胃癌患者首选的治疗措施，然而，有相当一部分患者确诊时已经为晚期，因而手术治疗效果较差，化疗药物也仅仅对于部分患者有效，且会导致患者出现一定的不良反应症状?医学研究结果证实，DNA甲基化在胃癌的发生和发展过程中起到了重要作用，因此，抑癌基因异常甲基化状态的逆转是一种较为有效的胃癌治疗方法?本次医学研究就对5-Aza-dC及TSA对人胃癌细胞株SGC-7901 Runx3基因甲基化和表达水平的影响进行了分析，现报道如下?
1 资料和方法
1.1 材料
本次医学研究所用材料包括：北京中杉金桥公司生产的β-Actin一抗?二抗，博奥森生物技术有限公司生产的Runx3兔抗人多克隆抗体，TAKARA公司提供的探针和引物，Fermentas公司生产的dNTP和Taq酶，Promega公司提供的RTPCR试剂盒，Invitrogen公司提供的RNA抽提试剂TRIzol，TAKARA公司提供的Real Time PCR试剂，GEPIGENTEK公司提供的DNA修饰试剂盒，TIANGEN公司提供的DNA提取试剂盒，GIBCO公司提供的RPMI1640培养基和胎牛血清，安徽医科大学分子生物学实验室提供的胃癌细胞?
1.2 方法
1.2.1 各组细胞中Runx3基因mRNA的表达
根据TRIzol试剂盒要求对各组细胞RNA进行提取，将其逆转录为cDNA，根据反应条件进行5min的95 ℃预变性扩增，分别在95 ℃ 30 s?52 ℃ 30 s?72 ℃中进行35个30 s的扩增循环，后用琼脂糖凝胶电泳试验对结果进行验证，通过Quantity One软件进行β-Actin基因和Runx3基因条带灰度值的分析，进行3次相同的实验，并对各组灰度值比值的mean±SD进行计算，以此作为Runx3 mRNA表达水平的结果?
1.2.2 各组细胞中Runx3基因蛋白的表达
按方法提取各组细胞蛋白，通过BCA蛋白浓度测定试剂盒对蛋白濃度进行测定，调节后的蛋白加上缓冲液煮沸5 min，保证其完全变性，通过15 V恒压和15%SDS-PAGE凝胶电泳进行30min的半干转膜，将凝胶上的蛋白置于PVDF膜上?在室温下用脱脂奶粉50g/L进行PVDF膜的1h封闭，加入一抗稀释液，在4 ℃环境中过夜孵育，后使用TBST漂洗PVDF膜进行4次8 min漂洗，加入二抗稀释液，连续1h在37 ℃环境中孵育，最后使用TBST漂洗PVDF膜进行4次8 min漂洗[1]?
1.3 统计学处理
本次医学研究通过SPSS17.0软件分析和处理所得数据?计数资料通过X2检验方法进行统计学处理，计量资料通过（x±s）方法进行统计学处理和表示，其他数据资料通过单因素方差分析法进行统计学处理，如果所得分析结果P<0.05，可以证实两组数据资料对比具有明显的统计学差异[2]?
2 结果
设定对照组甲基化水平为1，则其余各组细胞加药后，TSA组甲基化水平为0.63，5-Aza-d C组甲基化水平为0.7，TSA+5-Aza-d C组甲基化水平为0.37?各组细胞的Runx3基因的mRNA相对表达量为：对照组（0.14±0.04），5-Aza-d C组（0.29±0.02），TSA组（0.28±0.03），TSA+5-Aza-d C组（0.45±0.02），对照组相对表达量与各组相对表达量相比具有明显的统计学差异（P<0.05）?各组细胞中Runx3基因蛋白表达情况：对照组（0.09±0.02），TSA组（0.37±0.10），5-Aza-d C组（0.35±0.05），TSA+5-Aza-d C组（0.50±0.09），各组蛋白表达水平具有明显的统计学差异（P<0.05）?
3 讨论
肿瘤学研究结果提出，基因表达遗传学改变和遗传基因缺陷是诱发恶性肿瘤的主要原因，缺失和突变等基因缺陷均会对编码区功能和结构造成破坏，表观遗传学会诱导组蛋白乙酰化/去乙酰化或DNA甲基化等自身化学修饰方式发生一定的改变，进而达到DNA功能调控的作用[3]?mRNA表达水平结果证实，TSA和5-Aza-dC都会导致Runx3基因mRNA表达水平的增加，两药联合应用效果更加显著，由此可见，Runx3 mRNA启动子区甲基化水平与其表达水平之间存在直接联系，5-Aza-dC和TSA会对Runx3基因启动子区的异常甲基化状态产生逆转作用，进而形成Runx3基因的重新表达，并起到Runx3基因重新抑制癌症基因的效果?Runx3基因蛋白表达水平证实，各加药组m R NA表达水平越高，则蛋白表达水平也就越高，而这一结果也提高了实验结果的可靠性，并从蛋白表达水平的角度证实了5-Aza-dC和TSA的药效以及两药联合的协调作用?
参考文献
[1] 孟兰，程敏，沈国栋等.5-氮杂-2-脱氧胞苷和曲古抑菌素A对胃癌MGMT基因表达及NF-kB活性的影响[J].第三军医大学学报，2014，36（13）：1370-1371.
[2] 刘林青，胡世莲，沈干，等.5-氮杂-2-脱氧胞苷及曲古抑菌素A对人胃癌 SGC-7901细胞生长及CHFR基因表达水平的影响[J].中国癌症杂志，2012，22（8）：573-574.
[3] 董必文，段凤英，段训凰.5-氮-2-脱氧胞苷联合曲古抑菌素A对人肺腺癌细胞株 A549增殖和凋亡的影响[J].第三军医大学学报，2010，32（17）：1857-1860.
关键词：5-Aza-dC；人胃癌细胞株；SGC-7901 Runx3基因甲基化
【中图分类号】R735.2 【文献标识码】A 【文章编号】1672-8602（2015）04-0555-01
胃癌是一种发病率较高的恶性肿瘤，也是导致我国人民死亡的主要病因，该疾病在我国的死亡率和发病率均明显高出世界平均值?化疗药物治疗和手术治疗是胃癌患者首选的治疗措施，然而，有相当一部分患者确诊时已经为晚期，因而手术治疗效果较差，化疗药物也仅仅对于部分患者有效，且会导致患者出现一定的不良反应症状?医学研究结果证实，DNA甲基化在胃癌的发生和发展过程中起到了重要作用，因此，抑癌基因异常甲基化状态的逆转是一种较为有效的胃癌治疗方法?本次医学研究就对5-Aza-dC及TSA对人胃癌细胞株SGC-7901 Runx3基因甲基化和表达水平的影响进行了分析，现报道如下?
1 资料和方法
1.1 材料
本次医学研究所用材料包括：北京中杉金桥公司生产的β-Actin一抗?二抗，博奥森生物技术有限公司生产的Runx3兔抗人多克隆抗体，TAKARA公司提供的探针和引物，Fermentas公司生产的dNTP和Taq酶，Promega公司提供的RTPCR试剂盒，Invitrogen公司提供的RNA抽提试剂TRIzol，TAKARA公司提供的Real Time PCR试剂，GEPIGENTEK公司提供的DNA修饰试剂盒，TIANGEN公司提供的DNA提取试剂盒，GIBCO公司提供的RPMI1640培养基和胎牛血清，安徽医科大学分子生物学实验室提供的胃癌细胞?
1.2 方法
1.2.1 各组细胞中Runx3基因mRNA的表达
根据TRIzol试剂盒要求对各组细胞RNA进行提取，将其逆转录为cDNA，根据反应条件进行5min的95 ℃预变性扩增，分别在95 ℃ 30 s?52 ℃ 30 s?72 ℃中进行35个30 s的扩增循环，后用琼脂糖凝胶电泳试验对结果进行验证，通过Quantity One软件进行β-Actin基因和Runx3基因条带灰度值的分析，进行3次相同的实验，并对各组灰度值比值的mean±SD进行计算，以此作为Runx3 mRNA表达水平的结果?
1.2.2 各组细胞中Runx3基因蛋白的表达
按方法提取各组细胞蛋白，通过BCA蛋白浓度测定试剂盒对蛋白濃度进行测定，调节后的蛋白加上缓冲液煮沸5 min，保证其完全变性，通过15 V恒压和15%SDS-PAGE凝胶电泳进行30min的半干转膜，将凝胶上的蛋白置于PVDF膜上?在室温下用脱脂奶粉50g/L进行PVDF膜的1h封闭，加入一抗稀释液，在4 ℃环境中过夜孵育，后使用TBST漂洗PVDF膜进行4次8 min漂洗，加入二抗稀释液，连续1h在37 ℃环境中孵育，最后使用TBST漂洗PVDF膜进行4次8 min漂洗[1]?
1.3 统计学处理
本次医学研究通过SPSS17.0软件分析和处理所得数据?计数资料通过X2检验方法进行统计学处理，计量资料通过（x±s）方法进行统计学处理和表示，其他数据资料通过单因素方差分析法进行统计学处理，如果所得分析结果P<0.05，可以证实两组数据资料对比具有明显的统计学差异[2]?
2 结果
设定对照组甲基化水平为1，则其余各组细胞加药后，TSA组甲基化水平为0.63，5-Aza-d C组甲基化水平为0.7，TSA+5-Aza-d C组甲基化水平为0.37?各组细胞的Runx3基因的mRNA相对表达量为：对照组（0.14±0.04），5-Aza-d C组（0.29±0.02），TSA组（0.28±0.03），TSA+5-Aza-d C组（0.45±0.02），对照组相对表达量与各组相对表达量相比具有明显的统计学差异（P<0.05）?各组细胞中Runx3基因蛋白表达情况：对照组（0.09±0.02），TSA组（0.37±0.10），5-Aza-d C组（0.35±0.05），TSA+5-Aza-d C组（0.50±0.09），各组蛋白表达水平具有明显的统计学差异（P<0.05）?
3 讨论
肿瘤学研究结果提出，基因表达遗传学改变和遗传基因缺陷是诱发恶性肿瘤的主要原因，缺失和突变等基因缺陷均会对编码区功能和结构造成破坏，表观遗传学会诱导组蛋白乙酰化/去乙酰化或DNA甲基化等自身化学修饰方式发生一定的改变，进而达到DNA功能调控的作用[3]?mRNA表达水平结果证实，TSA和5-Aza-dC都会导致Runx3基因mRNA表达水平的增加，两药联合应用效果更加显著，由此可见，Runx3 mRNA启动子区甲基化水平与其表达水平之间存在直接联系，5-Aza-dC和TSA会对Runx3基因启动子区的异常甲基化状态产生逆转作用，进而形成Runx3基因的重新表达，并起到Runx3基因重新抑制癌症基因的效果?Runx3基因蛋白表达水平证实，各加药组m R NA表达水平越高，则蛋白表达水平也就越高，而这一结果也提高了实验结果的可靠性，并从蛋白表达水平的角度证实了5-Aza-dC和TSA的药效以及两药联合的协调作用?
参考文献
[1] 孟兰，程敏，沈国栋等.5-氮杂-2-脱氧胞苷和曲古抑菌素A对胃癌MGMT基因表达及NF-kB活性的影响[J].第三军医大学学报，2014，36（13）：1370-1371.
[2] 刘林青，胡世莲，沈干，等.5-氮杂-2-脱氧胞苷及曲古抑菌素A对人胃癌 SGC-7901细胞生长及CHFR基因表达水平的影响[J].中国癌症杂志，2012，22（8）：573-574.
[3] 董必文，段凤英，段训凰.5-氮-2-脱氧胞苷联合曲古抑菌素A对人肺腺癌细胞株 A549增殖和凋亡的影响[J].第三军医大学学报，2010，32（17）：1857-1860.