【摘 要】
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目的:探索并设计一种新颖的双靶点嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor, CAR）结构，获得相应CAR-T细胞并验证其对肿瘤细胞的体内外杀伤效果。方法:构建并制备5种包含人源化CD19 scFv和CD79b scFv、CD8 hinge＆TM-4-1BB-CD3ζ和/或CD3ε链胞内区的双靶点CAR-T细胞，荧光素酶法和ELISA法检测CAR-T细胞对3M-CD19-CD
【机 构】
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湖南省人民医院(湖南师范大学附属第一医院)血液内科
【基金项目】
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湖南省社会发展重点研发项目（2019SK2091）；
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目的:探索并设计一种新颖的双靶点嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor, CAR）结构，获得相应CAR-T细胞并验证其对肿瘤细胞的体内外杀伤效果。方法:构建并制备5种包含人源化CD19 scFv和CD79b scFv、CD8 hinge＆TM-4-1BB-CD3ζ和/或CD3ε链胞内区的双靶点CAR-T细胞，荧光素酶法和ELISA法检测CAR-T细胞对3M-CD19-CD79b-Luc靶细胞的杀伤能力和细胞因子的分泌，选取最优结构CAR-T细胞治疗Daudi-Luc细胞构建的白血病小鼠模型并评估其疗效，同时使用其他靶点代入优选结构，相同方法验证该结构的稳定性及有效性。结果:CAR-19-79b-T细胞培养7 d后，CAR-19表达率为21.6%-36.3%,CAR-79b表达率为21.7%-37.8%。CAR-19-79b-T细胞在10∶1效靶比时，对3M-CD19-CD79b-Luc细胞的杀伤率均显著高于T细胞对照组，其中CARⅢ、CARⅣ号结构细胞杀伤能力最强，均显著高于T细胞组（P＜0.01）;CARⅣ与CAR V结构IFN-γ和TNF-α的分泌量均最低，且两者间均无统计学意义（P＞0.05）。杀伤显著且分泌细胞因子水平低的CARⅣ细胞对Daudi-Luc白血病小鼠治疗效果明显，延长小鼠生存周期至64 d, T细胞对照组小鼠于（41.0±2.4）d全部死亡。相同结构构建的CAR-19-BCMA-T和CAR-19-22-T均表现出了显著的杀伤能力和较低的细胞因子水平。结论:成功设计了一种新颖的抗双靶点CAR-T细胞，能够高效杀伤相应的肿瘤细胞，同时分泌较少的细胞因子（如TNF-α,IFN-γ）,而且对Daudi淋巴瘤小鼠动物模型有显著的治疗效果，该双靶点CAR结构表现出良好的杀伤特异性和安全性。
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