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摘要 本研究选取辣椒轻斑驳病毒PMMoV、烟草花叶病毒TMV、黄瓜花叶病毒CMV和马铃薯Y病毒PVY作为试验材料，根据PMMoV衣壳蛋白(CP)RNA的序列特异性位点，设计出Taqman荧光探针及其引物，采用实时荧光RT-PCR技术对PMMoV进行快速检测，同时与ELISA方法进行了灵敏度比较，结果表明：该方法具有较高的灵敏度及较强的特异性，PMMoV检测结果为阳性，TMV、CMV和PVY均无荧光信号，为阴性，灵敏度是传统的ELISA方法的100倍，而且大大缩短了检测时间。该方法快速、准确、灵敏、简便、安全，具有实际应用价值，适用于植物病毒病害的快速检测。
关键词 辣椒轻斑驳病毒；实时荧光RT-PCR；双抗夹心酶联免疫吸附法
中图分类号 S436.418.12
甜(辣)椒(Capsicum sp．)广泛栽培于世界各地，是重要的蔬菜之一。辣椒轻斑驳病毒(Peppermild mottle virus，PMMoV)是甜椒上一种危害严重的病毒，PMMoV在很多国家都有报道。在美国、日本、英国等国家，该病造成感病辣椒叶片褪绿，果实小、斑驳和畸形，早期发病植株严重矮化等症状，在英国、日本保护地和美国一些地区辣椒上曾造成毁灭性危害。PMMoV属于烟草花叶病毒属(Tobamovirus)，病毒粒子杆状，为单组分正单链RNA病毒( ssRNA)，编码4个蛋白，即与病毒复制有关的126kDa、183kDa蛋白、移動蛋白(MP)和衣壳蛋白(CP)。该病毒可以种传和汁液摩擦传毒，介体不易传毒，带毒种子和感病植株是重要的侵染源。在我国该病毒少有报道，1994年向本春首次报道新疆辣椒上发现了辣椒轻斑驳病毒，谭根堂等在2003年报道了陕西线辣椒上病毒病优势毒原是PMMoV、CMV、蚕豆萎蔫病毒(BBWV)；2003年李明福等报道了引进的一辣椒新品种由于辣椒轻斑驳病毒在种植棚内暴发严重病害；2004年黄粤等用RT—PCR方法在山东青岛检测到辣椒轻斑驳病毒；2005年李兴红等报道在北京、宁夏两地田间甜椒上检测到辣椒轻斑驳病毒。2005年陈青等在进境辣椒种子中检出辣椒轻斑驳病毒。
病毒可以存活于种子的种皮、胚或胚乳内，有统计表明约10％的植物病毒被认为是可以通过种子传播的。病毒随感染的种子远距离调运传播，造成严重的经济损失。目前文献报道用于检测辣椒轻斑驳病毒的方法有：电镜检测法、酶联免疫吸附法(ELISA)和分子生物学检测方法(RT-PCR)。实时荧光RT-PCR方法是近年来发展起来的一种能有效缩短检测时间、提高检测灵敏度及准确度的新方法，广泛应用于动植物病害的检测。本研究应用实时荧光RT-PCR方法检测甜(辣)椒种子，能够快速灵敏地检测出其中的PMMoV，对预防该病毒随种子远距离传播有重要意义。建立种子中辣椒轻斑驳病毒快速、准确的检测方法，对进出口种子检验检疫、病毒病害防治预测具有指导意义。
1 材料与方法
1．1 供试材料
选择自然侵染甜椒的4种病毒CMV、TMV、PVY、PMMoV作为研究对象，其中PMMoV的2个分离物均来源于茄门甜椒，经分离纯化后分别保存在健康的甜椒上。本实验室保存在普通烟上的TMV、枯斑三生烟上的CMV及克利夫兰烟上的PVY。活体保存的植株叶片经DAS-ELISA检测分别呈PMMoV、TMV、CMV、PVY阳性。甜椒是这4种病毒的自然寄主。
本实验室保存的PMMoV衣壳蛋白基因部分克隆质粒为阳性对照，健康的甜椒叶片(DAS—ELISA检测呈阴性)作为阴性对照。
1．2 仪器及试剂
1．2．1 仪器
ABIT000实时荧光PCR仪(美国ABI公司)，5417R台式冷冻高速离心机(德国Eppendorf公司)，德国R302DT71K4-2原叶榨汁机，美国TE-CAN公司的SUNRISE酶联仪和洗板机。
1．2．2 试剂
荧光PCR：5×real-time PCR buffer(Mg2 free)、dNTP(s)(10 mmol/L)、MgCl2(250 mmol/L)、ExTaq DNA聚合酶(5 U/uL)，AMV反转录酶(5 U/uL)、Rnase inhibitor(40 U/uL)购于宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa)。
RNA提取试剂盒购于北京佰亿新创科技有限公司(BioFlux)。4种病毒的酶联检测试剂盒购自Agdia公司。引物和探针由上海英骏生物技术有限公司合成。
1．3 试验方法
1．3．1 探针及引物的设计与合成
GenBank中查询并下载4种病毒衣壳蛋白核酸序列，并进行序列比对，根据PMMoV共同的衣壳蛋白特异序列设计TaqMan荧光探针及其引物，序列如下：探针P 5’-TGTCGGCACTTCTCG-GAGCCTTTG-3’，探针5’末端标记报告荧光染料6-FAM，3’末端标记淬灭荧光染料TAMRA，上游引物F 5’-TTAGATTTCCTGCTACTG-GTTTCAA-3’，下游引物R 5’-CAGTTGTAG-GATTTTGCGGATTT-3’。
1．3．2 病毒RNA的提取
按照RNA提取试剂盒说明书的步骤提取RNA。
1．3．3 反转录合成cDNA
在反应管中加dNTP(2.5 mmol/L)8uL、Rnaseinhibitor(40 U/uL)1 uL、5×AMV Buffer 4uL、AMV(5 U/uL)2 p.L、下游引物R(20/umol/L)uL、RNA模板1uL，加DEPC处理水使总体积为20 uL，混匀，室温放置10 min，42℃水浴30 min，0℃冷却2 min，合成cDNA。
1．3．4 实时荧光PCR检测
1．3．4．1 反应体系
5×real-time PCR Buffer(Mg2 。free)5 uL、dNTP(s)(10 mmol/L)0.5uL、MgCl2(250 mmol/L)0.25uL、ExTaq HS DNA聚合酶(5 U/uL)0.25uL、引物(20umol/L)各0.7uL，探针(20umol/L)0.3uL，eDNA模板1uL，加灭菌双蒸水使总体积为25uL。试验选取采集的两个PMMoV分离物作为检测对象，添加灭菌双蒸水作为阴性对照，以监测试验过程的环境污染。
1．3．4．2 样本检测
将样品放入ABI 7000反应板上，打开电脑、仪器电源和软件，设置PCR反应条件：95℃5 min，然后95℃15 s，60℃1 min，45个循环。荧光PCR反 应约2 h结束，保存文件。
1．3．5 灵敏度测试
1．3．5．1 DAS-ELISA检测的灵敏度测试
将0.1 g感染PMMoV的辣椒叶片榨汁，用抽提缓冲液SEBl稀释汁液10×、102×、103×、104×、105×共5个浓度梯度，参照DAS-ELISA检测试剂盒说明书进行操作，加入底物后避光放置15 min用酶联仪测定405 nm下的吸光值并观察颜色变化。
1．3．5．2 实时荧光PCR检测的灵敏度测试
从0.1 g感染PMMoV的辣椒叶片中提取的RNA依次稀释10×、102×、103×、104×、105×共5個浓度梯度，反转录后进行实时荧光PCR检测。
2 结果与分析
2．1 实时荧光PCR检测
PMMoV毒源保存在甜椒上的叶片、感染TMV的普通烟叶片、感染CMV的枯斑三生烟叶片、感染PVY的克利夫兰烟叶片以及从健康甜椒上采集的叶片提取RNA，反转录合成cDNA作为模板，用于实时荧光PCR反应。打开分析软件，仪器自动分析试验结果，给出ARn(第n个循环时的荧光增加值)与循环数图像。反应结果表明：从检测的克隆PM-MoV衣壳蛋白基因质粒、从感染PMMoV，的叶片材料收集到强的荧光信号，Ct值为22～25，表现为阳性扩增，相同寄主上的其他病毒TMV、CMV、PVY以及健康甜椒和水对照均无荧光信号增加，表现为阴性(图1)，说明此探针及引物组合对PMMoV具有的特异性。
2．2 灵敏度试验
对辣椒叶片汁液稀释10×、102×、103×，经DAS-ELISA检测结果均为阳性，对104×、105×稀释的汁液检测结果为阴性，检测时间需要两个工作日才能完成。实时荧光PCR检测结果表明：当RNA稀释到105×时，实时荧光PCR仍能检测到(图2)。结果表明实时荧光PCR法比DA
关键词 辣椒轻斑驳病毒；实时荧光RT-PCR；双抗夹心酶联免疫吸附法
中图分类号 S436.418.12
甜(辣)椒(Capsicum sp．)广泛栽培于世界各地，是重要的蔬菜之一。辣椒轻斑驳病毒(Peppermild mottle virus，PMMoV)是甜椒上一种危害严重的病毒，PMMoV在很多国家都有报道。在美国、日本、英国等国家，该病造成感病辣椒叶片褪绿，果实小、斑驳和畸形，早期发病植株严重矮化等症状，在英国、日本保护地和美国一些地区辣椒上曾造成毁灭性危害。PMMoV属于烟草花叶病毒属(Tobamovirus)，病毒粒子杆状，为单组分正单链RNA病毒( ssRNA)，编码4个蛋白，即与病毒复制有关的126kDa、183kDa蛋白、移動蛋白(MP)和衣壳蛋白(CP)。该病毒可以种传和汁液摩擦传毒，介体不易传毒，带毒种子和感病植株是重要的侵染源。在我国该病毒少有报道，1994年向本春首次报道新疆辣椒上发现了辣椒轻斑驳病毒，谭根堂等在2003年报道了陕西线辣椒上病毒病优势毒原是PMMoV、CMV、蚕豆萎蔫病毒(BBWV)；2003年李明福等报道了引进的一辣椒新品种由于辣椒轻斑驳病毒在种植棚内暴发严重病害；2004年黄粤等用RT—PCR方法在山东青岛检测到辣椒轻斑驳病毒；2005年李兴红等报道在北京、宁夏两地田间甜椒上检测到辣椒轻斑驳病毒。2005年陈青等在进境辣椒种子中检出辣椒轻斑驳病毒。
病毒可以存活于种子的种皮、胚或胚乳内，有统计表明约10％的植物病毒被认为是可以通过种子传播的。病毒随感染的种子远距离调运传播，造成严重的经济损失。目前文献报道用于检测辣椒轻斑驳病毒的方法有：电镜检测法、酶联免疫吸附法(ELISA)和分子生物学检测方法(RT-PCR)。实时荧光RT-PCR方法是近年来发展起来的一种能有效缩短检测时间、提高检测灵敏度及准确度的新方法，广泛应用于动植物病害的检测。本研究应用实时荧光RT-PCR方法检测甜(辣)椒种子，能够快速灵敏地检测出其中的PMMoV，对预防该病毒随种子远距离传播有重要意义。建立种子中辣椒轻斑驳病毒快速、准确的检测方法，对进出口种子检验检疫、病毒病害防治预测具有指导意义。
1 材料与方法
1．1 供试材料
选择自然侵染甜椒的4种病毒CMV、TMV、PVY、PMMoV作为研究对象，其中PMMoV的2个分离物均来源于茄门甜椒，经分离纯化后分别保存在健康的甜椒上。本实验室保存在普通烟上的TMV、枯斑三生烟上的CMV及克利夫兰烟上的PVY。活体保存的植株叶片经DAS-ELISA检测分别呈PMMoV、TMV、CMV、PVY阳性。甜椒是这4种病毒的自然寄主。
本实验室保存的PMMoV衣壳蛋白基因部分克隆质粒为阳性对照，健康的甜椒叶片(DAS—ELISA检测呈阴性)作为阴性对照。
1．2 仪器及试剂
1．2．1 仪器
ABIT000实时荧光PCR仪(美国ABI公司)，5417R台式冷冻高速离心机(德国Eppendorf公司)，德国R302DT71K4-2原叶榨汁机，美国TE-CAN公司的SUNRISE酶联仪和洗板机。
1．2．2 试剂
荧光PCR：5×real-time PCR buffer(Mg2 free)、dNTP(s)(10 mmol/L)、MgCl2(250 mmol/L)、ExTaq DNA聚合酶(5 U/uL)，AMV反转录酶(5 U/uL)、Rnase inhibitor(40 U/uL)购于宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa)。
RNA提取试剂盒购于北京佰亿新创科技有限公司(BioFlux)。4种病毒的酶联检测试剂盒购自Agdia公司。引物和探针由上海英骏生物技术有限公司合成。
1．3 试验方法
1．3．1 探针及引物的设计与合成
GenBank中查询并下载4种病毒衣壳蛋白核酸序列，并进行序列比对，根据PMMoV共同的衣壳蛋白特异序列设计TaqMan荧光探针及其引物，序列如下：探针P 5’-TGTCGGCACTTCTCG-GAGCCTTTG-3’，探针5’末端标记报告荧光染料6-FAM，3’末端标记淬灭荧光染料TAMRA，上游引物F 5’-TTAGATTTCCTGCTACTG-GTTTCAA-3’，下游引物R 5’-CAGTTGTAG-GATTTTGCGGATTT-3’。
1．3．2 病毒RNA的提取
按照RNA提取试剂盒说明书的步骤提取RNA。
1．3．3 反转录合成cDNA
在反应管中加dNTP(2.5 mmol/L)8uL、Rnaseinhibitor(40 U/uL)1 uL、5×AMV Buffer 4uL、AMV(5 U/uL)2 p.L、下游引物R(20/umol/L)uL、RNA模板1uL，加DEPC处理水使总体积为20 uL，混匀，室温放置10 min，42℃水浴30 min，0℃冷却2 min，合成cDNA。
1．3．4 实时荧光PCR检测
1．3．4．1 反应体系
5×real-time PCR Buffer(Mg2 。free)5 uL、dNTP(s)(10 mmol/L)0.5uL、MgCl2(250 mmol/L)0.25uL、ExTaq HS DNA聚合酶(5 U/uL)0.25uL、引物(20umol/L)各0.7uL，探针(20umol/L)0.3uL，eDNA模板1uL，加灭菌双蒸水使总体积为25uL。试验选取采集的两个PMMoV分离物作为检测对象，添加灭菌双蒸水作为阴性对照，以监测试验过程的环境污染。
1．3．4．2 样本检测
将样品放入ABI 7000反应板上，打开电脑、仪器电源和软件，设置PCR反应条件：95℃5 min，然后95℃15 s，60℃1 min，45个循环。荧光PCR反 应约2 h结束，保存文件。
1．3．5 灵敏度测试
1．3．5．1 DAS-ELISA检测的灵敏度测试
将0.1 g感染PMMoV的辣椒叶片榨汁，用抽提缓冲液SEBl稀释汁液10×、102×、103×、104×、105×共5个浓度梯度，参照DAS-ELISA检测试剂盒说明书进行操作，加入底物后避光放置15 min用酶联仪测定405 nm下的吸光值并观察颜色变化。
1．3．5．2 实时荧光PCR检测的灵敏度测试
从0.1 g感染PMMoV的辣椒叶片中提取的RNA依次稀释10×、102×、103×、104×、105×共5個浓度梯度，反转录后进行实时荧光PCR检测。
2 结果与分析
2．1 实时荧光PCR检测
PMMoV毒源保存在甜椒上的叶片、感染TMV的普通烟叶片、感染CMV的枯斑三生烟叶片、感染PVY的克利夫兰烟叶片以及从健康甜椒上采集的叶片提取RNA，反转录合成cDNA作为模板，用于实时荧光PCR反应。打开分析软件，仪器自动分析试验结果，给出ARn(第n个循环时的荧光增加值)与循环数图像。反应结果表明：从检测的克隆PM-MoV衣壳蛋白基因质粒、从感染PMMoV，的叶片材料收集到强的荧光信号，Ct值为22～25，表现为阳性扩增，相同寄主上的其他病毒TMV、CMV、PVY以及健康甜椒和水对照均无荧光信号增加，表现为阴性(图1)，说明此探针及引物组合对PMMoV具有的特异性。
2．2 灵敏度试验
对辣椒叶片汁液稀释10×、102×、103×，经DAS-ELISA检测结果均为阳性，对104×、105×稀释的汁液检测结果为阴性，检测时间需要两个工作日才能完成。实时荧光PCR检测结果表明：当RNA稀释到105×时，实时荧光PCR仍能检测到(图2)。结果表明实时荧光PCR法比DA