【摘 要】
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目的 克隆和表达日本血吸虫大陆株次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)编码基因.方法 依据GenBank日本血吸虫HGPRT开放阅读框(ORF)设计一对引物,上游和下游引物分别引入BamH
【机 构】
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苏州大学医学院,中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所
【基金项目】
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上海市生物医药重点科技攻关项目;上海市科委资助项目;国家自然科学基金;国家高技术研究发展计划(863计划)
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目的 克隆和表达日本血吸虫大陆株次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)编码基因.方法 依据GenBank日本血吸虫HGPRT开放阅读框(ORF)设计一对引物,上游和下游引物分别引入BamH Ⅰ和Sal Ⅰ酶切位点.以日本血吸虫大陆株(安徽株,简称Sjc-A)成虫总RNA为模板,反转录PCR(RT-PCR)扩增日本血吸虫大陆株HGPRT(SjcHGPRT)全长编码基因.经双酶切纯化的PCR产物与同样双酶切纯化的pET28a质粒DNA片段用T4 DNA连接酶连接,构建重组质粒pET28a-SjcHGPRT,转化感受态E.coli BL21,并大量扩增.重组质粒DNA经限制性内切酶双酶切、PCR、琼脂糖凝胶电泳和核苷酸序列测定进行鉴定.pET28a-SjcHGPRT/E.coli BL21工程菌用IPTG诱导表达,重组蛋白用SDS-PAGE和Western blot分析.结果 SjcHGPRT编码基因RT-PCR产物约700 bp,构建的pET28a-SjcHGPRT重组质粒DNA经限制性内切酶双酶切和PCR扩增产物于琼脂糖凝胶电泳均观察到相同大小的基因片段,根据核苷酸序列测序结果推导的氨基酸序列与报道的日本血吸虫大陆株(湖南株,简称Sjc-H)及曼氏血吸虫HGPRT分别有99%和83%的同源性.获得的重组蛋白(reSjcHGPRT)经SDS-PAGE和Western blot分析,分子量约30 kDa,并能被抗His-G-HRP抗体、日本血吸虫感染小鼠血清和日本血吸虫病人血清识别.结论 日本血吸虫大陆株(安徽株)HGPRT表达获得成功,并获得了纯化重组蛋白,为开展该分子功能和免疫原性研究奠定了基础.
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