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摘要 本文对琼胶平板稀释纯化法进行了改良，建立了一种新方法一平板稀释画线分离法，既保留了其简单快速，操作方便，易于掌握的优点，又解决了可靠性差的缺点，适用于一些不易直接挑取的体积较小，颜色较淡的真菌孢子，如镰刀菌等，和传统分离方法相比节约了大量时间，适合大量样品的分离纯化。
关键词 真菌；单孢子；分离
中图分类号 S 432.1
由镰刀菌引起的赤霉病是世界潮湿、半潮湿地区麦类作物的一种重要病害，近年来在北美迅猛扩展，在欧洲和南美地区也呈蔓延趋势。在我国小麦赤霉病在北方地区已经上升为小麦的主要病害。镰刀菌不仅侵染作物造成产量损失，而且侵染谷物籽粒后产生的真菌毒素对人畜健康造成严重威胁，因此，科研工作者对其十分重视。研究镰刀菌群体遗传结构、性征和同宗或异宗配合等生理现象，都要求菌种由单个孢子分离繁殖而来。所以，建立一套简便高效的单孢子分离技术，能够节省大量的时间，有利于后续工作的进行。目前常用的分离方法主要有：琼胶平板稀释纯化法、琼胶平板表面单孢子挑取法、眉毛挑针法，固定昆虫针挑取法，铅笔柄挑孢针挑取法等，它们各有利弊。笔者在短时间内进行大量镰刀菌单孢子分离的过程中，通过试验对琼胶平板稀释纯化法进行了改良，建立了平板稀释画线分离法，提高了此方法的可靠性，这种方法的分离效率高，适合大批量样品的单孢子分离。
选取1条线只长出1个的菌落或1条线上相隔较远的2个菌落，距离较近的2个菌落和1条线上长出多个的菌落则舍弃，选取菌落部位的底部用记号笔做标记，在超净工作台内，将标记处培养基切下，转移至新的PDA平板中，28℃恒温培养。
1.3.7菌落形态鉴定
培养3d后，观察PDA培养基上的菌落形态，进行鉴定，去掉鉴定为非赤霉病菌的菌株。
2 结果与分析
2.1孢子出现几率统计
对200次显微镜计数结果进行统计，结果显示，2μL孢子悬浮液中出现1个孢子的几率为50％，无孢子出现的几率为35％，出现2个孢子的几率为12％，3～5个孢子的几率为3％(图2)。
2.2平板稀释画线分离菌株
从3545个小麦赤霉病穗中分离到4000株小麦赤霉病菌，总污染率1.96％，分离到非赤霉病菌32株，占0.8％，总的单孢子分离成功率为97.24％。
3 讨论
影响琼胶稀释平板法可靠性的主要因素为孢子悬浮液的浓度，浓度过高，多个孢子聚集在一起的几率较大，不能确定一个菌落是从单个孢子繁殖而来；而浓度过低可能长不出菌落。预试验确定了在孢子浓度为1个／μL时，每2μL孢子悬浮液中出现1个孢子的几率达到50％，而无孢子的几率为35％，这样单菌落由单孢子繁殖而来的可靠性就达到85％，只需继续改良试验方法，最大限度地排除出现2～5个孢子的15％情况即可得到可靠的单孢子分离物。
目前单孢子分离技术中广泛应用的主要有两种方法：琼胶平板稀释纯化法、琼胶平板表面单孢子挑取法。其中，直接挑取法虽然得到的单孢子可靠，但操作复杂，难度大，较为费时费力，不适合大量样品的分离，而且此方法更适用于体型大、有色、多细胞的真菌孢子如锈菌孢子，而镰刀菌的分生孢子无色透明，隔着平皿在显微镜下反差很小，用此方法分离难度很大。琼胶平板稀释纯化法操作简便快速，初学者也易于上手，但是由于这种方法实质上是分离菌落，不能看到和确定一个菌落是从单个孢子繁殖而来，纯化的可靠性较差。
作者所建立的平板稀释画线分离法，保留了琼胶平板稀释纯化法的优点，方法简单，初学者不用培训均可熟练掌握，分离效率高，适合各种类型真菌孢子的分离，尤其适合大量样品的单孢子分离。另外，通过单孢子出现几率的统计试验大大提高了平板画线的科学性，直接得单孢子繁殖菌落的几率达到85％，同时作者采用平板画线的方法，将2／xL孢子悬浮液涂成一条直线，试验证明如果含有2个孢子，也大多能够分散开，形成单独的2个菌落，将极少出现的一条线上2个或多个菌落重叠的情况舍弃，保证了得到单孢子菌落的可靠性。由于每2／xL孢子悬浮液中不含孢子的几率也达35％，作者采取在每个平板画5条线的方法增大孢子出现几率，在实际应用过程中，很少出现不长菌落的平板。
常规的赤霉病菌分离方法需要首先将病粒或穗轴用乙醇或次氯酸钠溶液进行表面消毒，放入PDA培养基培养，3d后取初分离物放入CLA培养基，日光灯和365nm近紫光灯12h光暗交替的组培架上诱导产孢，10d后产生大型分生孢子，或挑取初分离菌丝体至绿豆汤培养基中，26℃、120r／min振荡培养3d诱导产生孢子，之后进行单孢子分离。作者采用病穗颖壳直接在无菌水中蘸浸的方法得到孢子悬浮液，比传统方法节约时间6～13d，大大提高了工作效率。但直接从病组织上获取孢子，画线平板可能会少数出现细菌污染，因此需注意对单孢子转移纯化时的无菌操作，注意舍弃污染的菌落，并且在转移单孢子的PDA培养基中加入医用氯霉素来抑制细菌生长(画线平板不加抗生素，否则可能会影响孢子萌发率)，取得了很好的效果，笔者用此方法大量分离镰刀菌，污染率小于2％。
本方法还需要严格控制培养时间，在菌落微小的时候及时观察并转移至新培养基，否则菌落长大后，距离较近的两个菌落难于区分，影响方法的可靠性，禾谷镰刀菌在30h为宜，最长不能超过36h。
本方法步骤简单、分工明确，适合实验室多人合作，能够显著提高分离效率，笔者所在实验室采用稀释平板画线法在短时间内完成了采自全国各地3500余个小麦赤霉病病穗的单孢子分离，其高效性得到了很好的体现。
关键词 真菌；单孢子；分离
中图分类号 S 432.1
由镰刀菌引起的赤霉病是世界潮湿、半潮湿地区麦类作物的一种重要病害，近年来在北美迅猛扩展，在欧洲和南美地区也呈蔓延趋势。在我国小麦赤霉病在北方地区已经上升为小麦的主要病害。镰刀菌不仅侵染作物造成产量损失，而且侵染谷物籽粒后产生的真菌毒素对人畜健康造成严重威胁，因此，科研工作者对其十分重视。研究镰刀菌群体遗传结构、性征和同宗或异宗配合等生理现象，都要求菌种由单个孢子分离繁殖而来。所以，建立一套简便高效的单孢子分离技术，能够节省大量的时间，有利于后续工作的进行。目前常用的分离方法主要有：琼胶平板稀释纯化法、琼胶平板表面单孢子挑取法、眉毛挑针法，固定昆虫针挑取法，铅笔柄挑孢针挑取法等，它们各有利弊。笔者在短时间内进行大量镰刀菌单孢子分离的过程中，通过试验对琼胶平板稀释纯化法进行了改良，建立了平板稀释画线分离法，提高了此方法的可靠性，这种方法的分离效率高，适合大批量样品的单孢子分离。
选取1条线只长出1个的菌落或1条线上相隔较远的2个菌落，距离较近的2个菌落和1条线上长出多个的菌落则舍弃，选取菌落部位的底部用记号笔做标记，在超净工作台内，将标记处培养基切下，转移至新的PDA平板中，28℃恒温培养。
1.3.7菌落形态鉴定
培养3d后，观察PDA培养基上的菌落形态，进行鉴定，去掉鉴定为非赤霉病菌的菌株。
2 结果与分析
2.1孢子出现几率统计
对200次显微镜计数结果进行统计，结果显示，2μL孢子悬浮液中出现1个孢子的几率为50％，无孢子出现的几率为35％，出现2个孢子的几率为12％，3～5个孢子的几率为3％(图2)。
2.2平板稀释画线分离菌株
从3545个小麦赤霉病穗中分离到4000株小麦赤霉病菌，总污染率1.96％，分离到非赤霉病菌32株，占0.8％，总的单孢子分离成功率为97.24％。
3 讨论
影响琼胶稀释平板法可靠性的主要因素为孢子悬浮液的浓度，浓度过高，多个孢子聚集在一起的几率较大，不能确定一个菌落是从单个孢子繁殖而来；而浓度过低可能长不出菌落。预试验确定了在孢子浓度为1个／μL时，每2μL孢子悬浮液中出现1个孢子的几率达到50％，而无孢子的几率为35％，这样单菌落由单孢子繁殖而来的可靠性就达到85％，只需继续改良试验方法，最大限度地排除出现2～5个孢子的15％情况即可得到可靠的单孢子分离物。
目前单孢子分离技术中广泛应用的主要有两种方法：琼胶平板稀释纯化法、琼胶平板表面单孢子挑取法。其中，直接挑取法虽然得到的单孢子可靠，但操作复杂，难度大，较为费时费力，不适合大量样品的分离，而且此方法更适用于体型大、有色、多细胞的真菌孢子如锈菌孢子，而镰刀菌的分生孢子无色透明，隔着平皿在显微镜下反差很小，用此方法分离难度很大。琼胶平板稀释纯化法操作简便快速，初学者也易于上手，但是由于这种方法实质上是分离菌落，不能看到和确定一个菌落是从单个孢子繁殖而来，纯化的可靠性较差。
作者所建立的平板稀释画线分离法，保留了琼胶平板稀释纯化法的优点，方法简单，初学者不用培训均可熟练掌握，分离效率高，适合各种类型真菌孢子的分离，尤其适合大量样品的单孢子分离。另外，通过单孢子出现几率的统计试验大大提高了平板画线的科学性，直接得单孢子繁殖菌落的几率达到85％，同时作者采用平板画线的方法，将2／xL孢子悬浮液涂成一条直线，试验证明如果含有2个孢子，也大多能够分散开，形成单独的2个菌落，将极少出现的一条线上2个或多个菌落重叠的情况舍弃，保证了得到单孢子菌落的可靠性。由于每2／xL孢子悬浮液中不含孢子的几率也达35％，作者采取在每个平板画5条线的方法增大孢子出现几率，在实际应用过程中，很少出现不长菌落的平板。
常规的赤霉病菌分离方法需要首先将病粒或穗轴用乙醇或次氯酸钠溶液进行表面消毒，放入PDA培养基培养，3d后取初分离物放入CLA培养基，日光灯和365nm近紫光灯12h光暗交替的组培架上诱导产孢，10d后产生大型分生孢子，或挑取初分离菌丝体至绿豆汤培养基中，26℃、120r／min振荡培养3d诱导产生孢子，之后进行单孢子分离。作者采用病穗颖壳直接在无菌水中蘸浸的方法得到孢子悬浮液，比传统方法节约时间6～13d，大大提高了工作效率。但直接从病组织上获取孢子，画线平板可能会少数出现细菌污染，因此需注意对单孢子转移纯化时的无菌操作，注意舍弃污染的菌落，并且在转移单孢子的PDA培养基中加入医用氯霉素来抑制细菌生长(画线平板不加抗生素，否则可能会影响孢子萌发率)，取得了很好的效果，笔者用此方法大量分离镰刀菌，污染率小于2％。
本方法还需要严格控制培养时间，在菌落微小的时候及时观察并转移至新培养基，否则菌落长大后，距离较近的两个菌落难于区分，影响方法的可靠性，禾谷镰刀菌在30h为宜，最长不能超过36h。
本方法步骤简单、分工明确，适合实验室多人合作，能够显著提高分离效率，笔者所在实验室采用稀释平板画线法在短时间内完成了采自全国各地3500余个小麦赤霉病病穗的单孢子分离，其高效性得到了很好的体现。