【摘 要】
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【背景】巴斯德毕赤酵母（Komagataella phaffii）是一种甲基营养型酵母，近年来作为生产重组蛋白和构建生物合成途径的细胞工厂受到广泛关注。实时荧光定量PCR （real-time quantitative PCR，RT-qPCR）是巴斯德毕赤酵母表达系统研究中一种快速、高效的基因表达水平检测技术，但需要进行归一化处理才能保证得到的结果的可靠性。【目的】筛选并验证巴斯德毕赤酵母在不同生
【机 构】
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江南大学粮食发酵与食品生物制造国家工程研究中心
【基金项目】
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国家重点研发计划（2021YFC2100203）； 国家自然科学基金（21908077）；
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【背景】巴斯德毕赤酵母（Komagataella phaffii）是一种甲基营养型酵母，近年来作为生产重组蛋白和构建生物合成途径的细胞工厂受到广泛关注。实时荧光定量PCR （real-time quantitative PCR，RT-qPCR）是巴斯德毕赤酵母表达系统研究中一种快速、高效的基因表达水平检测技术，但需要进行归一化处理才能保证得到的结果的可靠性。【目的】筛选并验证巴斯德毕赤酵母在不同生长阶段最稳定的内参基因用于精准归一化RT-qPCR的结果。【方法】通过转录组数据分析初步筛选出16个候选内参基因（rps8b、rpl35a、rpl10、eif5a、rpl19a、por1、rpl23b、0887、tif1、ole1、rpl14b、gs、sun、sdh2、trx1和ccp1）。通过RT-qPCR技术得到候选内参基因的Ct值，利用qBASE软件中的geNorm程序综合NormFinder算法评估内参基因的表达稳定性。【结果】通过geNorm分析得出精准归一化所需的最佳内参基因个数为2，最稳定的基因是rpl19a和tif1，NormFinder分析得到稳定性最高的内参基因为tif1。此外，利用甲酸脱氢酶编码基因fdh和乙醇脱氢酶甲醛脱氢酶双功能酶的编码基因afdh对候选内参基因进行验证。【结论】巴斯德毕赤酵母不同生长阶段的RT-qPCR进行精准归一化需要tif1和rpl19a这2个内参基因，为相关功能基因的表达定量提供了可靠的分析依据，补充了RT-qPCR分析中的内参基因，为巴斯德毕赤酵母不同生长阶段的基因表达调控及其应用研究提供了新的参考。
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